黑尾葉蟬Nephotettix cincticeps(Uhler)屬于半翅目葉蟬科,是我國水稻上重要害蟲之一。黑尾葉蟬除刺吸取食水稻汁液為害外,還能傳播水稻矮縮病毒(rice dwarf virus,RDV),對水稻造成了嚴重危害。昆蟲先天免疫是昆蟲防御病原微生物的首道防線,而肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)則是昆蟲免疫系統(tǒng)中的重要免疫識別蛋白,在昆蟲產(chǎn)生抗菌肽等免疫物質(zhì)的過程中起到重要調(diào)控作用。黑尾葉蟬作為RDV的介體昆蟲,目前關(guān)于RDV對黑尾葉蟬免疫能力影響的相關(guān)報道較少。本文通過轉(zhuǎn)錄組分析,得到數(shù)個黑尾葉蟬PGRPs基因,篩選出其中轉(zhuǎn)錄水平被RDV所抑制的PGRPs,通過基因克隆及原核表達研究NcPGRP分子特性和蛋白特性,利用定量PCR和RNAi技術(shù)研究NcPGRP在黑尾葉蟬免疫反應(yīng)中的功能。主要研究內(nèi)容如下:1.以各常見昆蟲PGRP基因作為參考序列,通過本地blast從黑尾葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到12個E值(E-Value)較高的PGRPs基因。利用定量PCR檢測感染RDV黑尾葉蟬體內(nèi)各PGRPs的表達量,篩選出3個...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 文獻綜述
    1.1 昆蟲先天免疫
        1.1.1 細胞免疫
        1.1.2 體液免疫
    1.2 肽聚糖識別蛋白在昆蟲免疫中的作用
        1.2.1 PGRP的結(jié)構(gòu)特點
        1.2.2 PGRP的功能
    1.3 肽聚糖識別蛋白對黑尾葉蟬與RDV互作關(guān)系的影響
        1.3.1 水稻普通矮縮病毒與黑尾葉蟬
        1.3.2 黑尾葉蟬對水稻矮縮病毒的傳播和獲取
        1.3.3 昆蟲肽聚糖識別蛋白與病毒的互作關(guān)系
    1.4 研究目的及意義
第二章 黑尾葉蟬PGRP基因注釋及與RDV互作相關(guān)PGRP篩選
    2.1 材料與方法
        2.1.1 供試昆蟲與水稻
        2.1.2 主要實驗試劑與儀器
        2.1.3 常見昆蟲PGRP基因組數(shù)據(jù)收集
        2.1.4 本地Blast的基本操作過程
        2.1.5 總RNA提取及cDNA第一鏈合成
        2.1.6 取樣
        2.1.7 熒光定量PCR檢測表達水平
        2.1.8 數(shù)據(jù)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 黑尾葉蟬肽聚糖識別蛋白基因篩選結(jié)果
        2.2.2 RDV感染對黑尾葉蟬PGRPs轉(zhuǎn)錄水平的影響
    2.3 討論
第三章 黑尾葉蟬NcPGRP基因的克隆與組織分布分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 供試昆蟲與水稻
        3.1.2 主要實驗試劑與儀器
        3.1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成
        3.1.4 瓊脂糖凝膠電泳
        3.1.5 分子克隆
        3.1.6 黑尾葉蟬NcPGRP基因的生物學(xué)分析
        3.1.7 黑尾葉蟬各組織NcPGRP基因轉(zhuǎn)錄水平分析
        3.1.8 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 黑尾葉蟬NcPGRP基因的克隆驗證與序列分析
        3.2.2 黑尾葉蟬NcPGRP基因的多序列比對及進化分析
        3.2.3 黑尾葉蟬NcPGRP基因組織分布分析
    3.3 討論
第四章 黑尾葉蟬NcPGRP的原核表達、抗體制備及Western Blot
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試昆蟲與水稻
        4.1.2 主要試劑盒實驗儀器
        4.1.3 黑尾葉蟬NcPGRP基因重組表達質(zhì)粒構(gòu)建
        4.1.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達
        4.1.5 重組蛋白的SDS-PAGE檢測
        4.1.6 重組蛋白的western blot驗證
        4.1.7 重組蛋白純化
        4.1.8 純化蛋白的透析
        4.1.9 純化蛋白濃度測定
        4.1.10 Western Blot驗證抗體效果
        4.1.11 取樣
        4.1.12 SDS-PAGE
        4.1.13 Western Blot
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 黑尾葉蟬NcPGRP蛋白原核表達
        4.2.2 黑尾葉蟬NcPGRP原核表達蛋白純化
        4.2.3 黑尾葉蟬NcPGRP蛋白的western blot分析
    4.3 討論
第五章 黑尾葉蟬NcPGRP基因的免疫刺激及RNA干擾
    5.1 材料與方法
        5.1.1 供試昆蟲與水稻
        5.1.2 實驗試劑與儀器
        5.1.3 大腸桿菌E.DH5α 和藤黃微球菌M.luteus的培養(yǎng)和活化
        5.1.4病原細菌的顯微注射
        5.1.5 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成
        5.1.6 黑尾葉蟬NcPGRP基因免疫刺激后轉(zhuǎn)錄水平的定量分析
        5.1.7 dsRNA合成
        5.1.8 dsRNA的注射
        5.1.9 數(shù)據(jù)分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 RDV對黑尾葉蟬NcPGRP基因的抑制作用
        5.2.2 病原細菌對NcPGRP基因的誘導(dǎo)結(jié)果分析
        5.2.3 黑尾葉蟬NcPGRP基因的RNA干擾條件篩選
        5.2.4 病原細菌感染對RNA干擾后黑尾葉蟬死亡率的影響
    5.3 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3789927