抗病毒RNAi是一類廣泛而且保守的表觀遺傳學(xué)調(diào)控過程,近似于RNAi介導(dǎo)的基因沉默。病毒侵染后,復(fù)制中產(chǎn)生的雙鏈RNA(ds RNAs)被Dicer蛋白識別并切割成長度為21-30 nt的si RNA,si RNA與AGO形成RISC復(fù)合體誘導(dǎo)病毒RNA的降解或翻譯。擬南芥共編碼4種DCL蛋白和5種DRB蛋白。其中,DCL4切割產(chǎn)生的21 nt的si RNA在抗病毒免疫中起主要作用。DCL4與雙鏈RNA(ds RNA)結(jié)合蛋白(ds RBP)DRB4的特異性相互作用在植物內(nèi)源si RNA的產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用,然而,DRB4在抗病毒過程中的具體功能還未知。本研究通過CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)獲得drb4突變體,接種病毒后發(fā)現(xiàn),病毒含量在drb4突變體中并未明顯增加,可能其它DRB存在重復(fù)功能。然而,我們研究發(fā)現(xiàn)DRB4與實(shí)驗(yàn)室新發(fā)現(xiàn)的抗病毒調(diào)控因子GLTP1和LPEAT1相互作用。此外,我們發(fā)現(xiàn),在抗病毒RNAi缺陷的ala1/ala2突變體,DRB4-YFP融合蛋白的定位發(fā)生明顯變化。本研究結(jié)果為揭示DRB4在抗病毒RNAi中的具體功能奠定了一定基礎(chǔ)。番茄是一種重要的經(jīng)濟(jì)蔬菜作物...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 RNAi介導(dǎo)的抗病毒免疫機(jī)制
        1.1.1 RNAi
        1.1.2 植物中RNAi介導(dǎo)的抗病毒免疫途徑
    1.2 雙鏈RNA結(jié)合蛋白4(DRB4)的研究進(jìn)展
        1.2.1 雙鏈RNA結(jié)合蛋白DRB4
        1.2.3 植物中DRB4的抗病毒功能研究
    1.3 番茄中RNAi介導(dǎo)的抗病毒研究進(jìn)展
    1.4 黃瓜花葉病毒的研究進(jìn)展
        1.4.1 黃瓜花葉病毒的發(fā)生及分布
        1.4.2 黃瓜花葉病毒的基因組結(jié)構(gòu)及其功能
        1.4.3 基于CMV-Δ2b的抗病毒基因篩選系統(tǒng)
        1.4.4 黃瓜花葉病毒的癥狀與檢測
        1.4.5 黃瓜花葉病毒的防治
    1.5 技術(shù)體系簡介
        1.5.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系
        1.5.2 Nothern Blot印跡雜交
        1.5.3 雙分子熒光互補(bǔ)BiFC
    1.6 立題依據(jù)及意義
第二章 DRB4 在抗病毒RNAi中的作用機(jī)理
    2.1 試驗(yàn)材料
    2.2 試驗(yàn)試劑
    2.3 培養(yǎng)基及抗生素配制
    2.4 試驗(yàn)方法
        2.4.1 構(gòu)建CRISPR/CAS9 雙元表達(dá)載體
        2.4.2 構(gòu)建DRB4亞細(xì)胞定位表達(dá)載體
        2.4.3 構(gòu)建BiFC表達(dá)載體
        2.4.4 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的制備
        2.4.5 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的轉(zhuǎn)化
        2.4.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的野生型擬南芥Col轉(zhuǎn)基因及遺傳篩選
        2.4.7 CTAB法提取drb4 突變體DNA及 PCR鑒定
        2.4.8 Fny-CMV及 VSR突變體病毒摩擦接種擬南芥
        2.4.9 Trizol法提取植物總RNA
        2.4.10 Northern Blot檢測CMV-mRNA積累量
        2.4.11 Northern Blot檢測病毒siRNA積累量
        2.4.12 本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)DRB4蛋白
    2.5 結(jié)果與分析
        2.5.1 DRB4 的抗病毒RNAi功能分析
        2.5.2 DRB4的亞細(xì)胞定位分析
        2.5.3 BiFC檢測DRB4 與其他抗病毒因子的互作
    2.6 小結(jié)與討論
第三章 番茄中抗病毒RNAi的初步研究
    3.1 試驗(yàn)材料
    3.2 試驗(yàn)試劑
    3.3 試驗(yàn)方法
        3.3.1 Fny-CMV及 VSR突變體病毒摩擦接種番茄
        3.3.2 Western Blot檢測CMV-CP蛋白的積累量
        3.3.3 Northern Blot檢測CMV-mRNA的積累量
        3.3.4 構(gòu)建CRISPR/CAS9 雙元表達(dá)載體
        3.3.5 番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 CMV對番茄的侵染性分析
        3.4.2 CRISPR敲除番茄DCLs、AGOs及 RDRs基因
    3.5 小結(jié)與討論
第四章 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄 引物
致謝



本文編號：3789164