水稻是重要的糧食作物之一,世界一半以上的人口都以它為主糧。穩(wěn)定的水稻產(chǎn)量維系著國家糧食安全與社會安定。但是水稻幾乎在其生長發(fā)育的各個時期都會受到相應(yīng)害蟲的侵害,而二化螟則是其中影響最為嚴重的害蟲之一。近幾十年來,BT轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)的應(yīng)用有效地控制了部分主要害蟲對作物的侵害,減少了經(jīng)濟損失,同時減輕了農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的破壞。然而我們也應(yīng)該注意到,由于BT殺蟲蛋白的選擇壓力,在實驗室已然出現(xiàn)了 BT抗性個體。盡管科研工作者們已被動地采取了一些措施來控制這些抗性個體的發(fā)展,但是我們更應(yīng)該采取更加積極主動的態(tài)度,開發(fā)有效控制害蟲的新策略。RNAi技術(shù)在近二十年來,從發(fā)現(xiàn)到認識再到應(yīng)用,逐漸成為害蟲防治領(lǐng)域最有希望能夠比肩BT轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)的潛力策略。本研究基于以上初衷,嘗試將該策略應(yīng)用到水稻的害蟲防治上。主要結(jié)果如下:1.測序并收錄水稻8種重要害蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),整理并構(gòu)建水稻害蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(http://rptdb.hzau.edu.cn),旨在為世界范圍內(nèi)的昆蟲功能基因組、昆蟲治理等學(xué)科科研工作者提供相關(guān)數(shù)據(jù),以彌補這些遺傳信息的缺乏。統(tǒng)計90日內(nèi)數(shù)據(jù)庫的日均獨立訪客數(shù)為25次。2.選取22...

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 研究問題的由來
    2 RNAi技術(shù)概述
        2.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        2.2 小RNA的分類及其機制
            2.2.1 Dicer蛋白與AGO(Argonaut)蛋白
            2.2.2 siRNA
            2.2.3 miRNA
            2.2.4 piRNA
    3 RNAi在植物保護領(lǐng)域的應(yīng)用
        3.1 害蟲防治的現(xiàn)實問題
        3.2 RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治
            3.2.1 dsRNA的合成
            3.2.2 dsRNA進入昆蟲的方式
            3.2.3 昆蟲體內(nèi)RNAi反應(yīng)的分類
            3.2.4 昆蟲吸收dsRNA的機制
                3.2.4.1 跨膜通道介導(dǎo)的dsRNA吸收機制
                3.2.4.2 細胞內(nèi)吞介導(dǎo)的dsRNA吸收途徑
                3.2.4.3 免疫相關(guān)途徑
            3.2.5 與系統(tǒng)性RNAi關(guān)系密切的蛋白
            3.2.6 dsRNA靶基因的選擇
            3.2.7 miRNA介導(dǎo)的害蟲防治
        3.3 RNAi抗蟲面臨的問題和挑戰(zhàn)
            3.3.1 dsRNA劑量不足
            3.3.2 dsRNase對取食攝入dsRNA的快速降解
            3.3.3 脫靶效應(yīng)和邊緣效應(yīng)
    4 分離轉(zhuǎn)錄起始位點及終止位點的方法
    5 本研究的目的與意義
第二章 水稻主要害蟲轉(zhuǎn)錄組分析及數(shù)據(jù)庫建設(shè)
    1 試驗材料
        1.1 8種水稻重要害蟲轉(zhuǎn)錄組的獲得
    2 試驗方法
        2.1 Unigene的注釋
        2.2 直系同源(ortholog)和旁系同源(paralog)預(yù)測
        2.3 進化關(guān)系分析
        2.4 數(shù)據(jù)庫的實現(xiàn)
    3 結(jié)果與分析
        3.1 各個轉(zhuǎn)錄組的基本信息
        3.2 進化分析結(jié)果
            3.2.1 物種進化樹
        3.3 數(shù)據(jù)庫界面及操作
            3.3.1 數(shù)據(jù)瀏覽
            3.3.2 數(shù)據(jù)檢索
    4 討論
        4.1 昆蟲轉(zhuǎn)錄組的差異
        4.2 物種分化時間
第三章 利用RNAi技術(shù)培育抗二化螟水稻
    1 試驗材料
        1.1 水稻品種
        1.2 載體與菌株
        1.3 二化螟幼蟲
        1.4 miRNA抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻csu-15
    2 試驗方法
        2.1 二化螟總RNA的抽提及反轉(zhuǎn)錄
        2.2 候選靶標片段的選擇
        2.3 干涉載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4 轉(zhuǎn)化植株的T₀代陽性檢測
        2.5 利用Southern blotting對轉(zhuǎn)化植株進行拷貝數(shù)檢測
            2.5.1 植物基因組大量樣品抽提
            2.5.2 基因組DNA的檢測
            2.5.3 酶切和虹吸法轉(zhuǎn)膜印記
            2.5.4 預(yù)雜交
            2.5.5 標探針、加探針
            2.5.6 洗膜及壓磷屏顯像
        2.6 轉(zhuǎn)化植株的表達量檢測
        2.7 體外dsRNA的人工合成
        2.8 喂蟲試驗
            2.8.1 人工飼料飼喂
            2.8.2 室內(nèi)幼苗飼喂
            2.8.3 室內(nèi)莖稈接蟲
                2.8.3.1 短期莖稈抗蟲鑒定
                2.8.3.2 二化螟全生育期連續(xù)喂食
        2.9 喂食csu-15材料的二化螟中腸組織差異表達分析
            2.9.1 二化螟中腸組織RNA分離及測序
            2.9.2 差異表達分析
            2.9.3 miRNA靶標預(yù)測
    3 結(jié)果與分析
        3.1 dsRNA的合成
        3.2 dsRNA人工飼料飼喂試驗結(jié)果
        3.3 轉(zhuǎn)化片段植株拷貝數(shù)檢測及表達量檢測
            3.3.1 植株拷貝數(shù)檢測
            3.3.2 植株表達量檢測
        3.4 室內(nèi)莖稈飼喂結(jié)果
        3.5 csu-15二化螟抗性鑒定及喂食后二化螟中腸差異表達分析
            3.5.1 csu-15轉(zhuǎn)基因植株對二化螟的抗性鑒定
            3.5.2 二化螟中腸差異表達分析
    4 討論
        4.1 RNAi抗蟲策略遇到的問題與解決思路
        4.2 dsRNA抗蟲與miRNA抗蟲的比較
第四章 水稻全長cDNA PET文庫構(gòu)建及分析
    1 試驗材料
    2 試驗方法
        2.1 RNA抽提
        2.2 全長cDNA的獲得與文庫制備
        2.3 測序
        2.4 數(shù)據(jù)分析及評估
    3 結(jié)果與分析
        3.1 測序與TSS-PAS對提取結(jié)果
        3.2 兩個水稻數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果
            3.2.1 RAGP 7比對結(jié)果
            3.2.2 KOME比對結(jié)果
            3.2.3 可變的轉(zhuǎn)錄起始位點或轉(zhuǎn)錄終止位點
    4 討論
        4.1 全長cDNA PET文庫構(gòu)建
        4.2 利用RAPG 7與KOME數(shù)據(jù)庫對本策略的評估
        4.3 與三代測序全長轉(zhuǎn)錄組的比較
參考文獻
附錄1 全長cDNA文庫構(gòu)建過程中涉及的自定義序列
致謝



本文編號：3784347