水稻是重要的糧食作物之一,世界一半以上的人口都以它為主糧。穩(wěn)定的水稻產(chǎn)量維系著國家糧食安全與社會(huì)安定。但是水稻幾乎在其生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都會(huì)受到相應(yīng)害蟲的侵害,而二化螟則是其中影響最為嚴(yán)重的害蟲之一。近幾十年來,BT轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)的應(yīng)用有效地控制了部分主要害蟲對(duì)作物的侵害,減少了經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)減輕了農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞。然而我們也應(yīng)該注意到,由于BT殺蟲蛋白的選擇壓力,在實(shí)驗(yàn)室已然出現(xiàn)了 BT抗性個(gè)體。盡管科研工作者們已被動(dòng)地采取了一些措施來控制這些抗性個(gè)體的發(fā)展,但是我們更應(yīng)該采取更加積極主動(dòng)的態(tài)度,開發(fā)有效控制害蟲的新策略。RNAi技術(shù)在近二十年來,從發(fā)現(xiàn)到認(rèn)識(shí)再到應(yīng)用,逐漸成為害蟲防治領(lǐng)域最有希望能夠比肩BT轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)的潛力策略。本研究基于以上初衷,嘗試將該策略應(yīng)用到水稻的害蟲防治上。主要結(jié)果如下:1.測序并收錄水稻8種重要害蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),整理并構(gòu)建水稻害蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(http://rptdb.hzau.edu.cn),旨在為世界范圍內(nèi)的昆蟲功能基因組、昆蟲治理等學(xué)科科研工作者提供相關(guān)數(shù)據(jù),以彌補(bǔ)這些遺傳信息的缺乏。統(tǒng)計(jì)90日內(nèi)數(shù)據(jù)庫的日均獨(dú)立訪客數(shù)為25次。2.選取22...

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

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中文摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 研究問題的由來
    2 RNAi技術(shù)概述
        2.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        2.2 小RNA的分類及其機(jī)制
            2.2.1 Dicer蛋白與AGO(Argonaut)蛋白
            2.2.2 siRNA
            2.2.3 miRNA
            2.2.4 piRNA
    3 RNAi在植物保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用
        3.1 害蟲防治的現(xiàn)實(shí)問題
        3.2 RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治
            3.2.1 dsRNA的合成
            3.2.2 dsRNA進(jìn)入昆蟲的方式
            3.2.3 昆蟲體內(nèi)RNAi反應(yīng)的分類
            3.2.4 昆蟲吸收dsRNA的機(jī)制
                3.2.4.1 跨膜通道介導(dǎo)的dsRNA吸收機(jī)制
                3.2.4.2 細(xì)胞內(nèi)吞介導(dǎo)的dsRNA吸收途徑
                3.2.4.3 免疫相關(guān)途徑
            3.2.5 與系統(tǒng)性RNAi關(guān)系密切的蛋白
            3.2.6 dsRNA靶基因的選擇
            3.2.7 miRNA介導(dǎo)的害蟲防治
        3.3 RNAi抗蟲面臨的問題和挑戰(zhàn)
            3.3.1 dsRNA劑量不足
            3.3.2 dsRNase對(duì)取食攝入dsRNA的快速降解
            3.3.3 脫靶效應(yīng)和邊緣效應(yīng)
    4 分離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及終止位點(diǎn)的方法
    5 本研究的目的與意義
第二章 水稻主要害蟲轉(zhuǎn)錄組分析及數(shù)據(jù)庫建設(shè)
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 8種水稻重要害蟲轉(zhuǎn)錄組的獲得
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 Unigene的注釋
        2.2 直系同源(ortholog)和旁系同源(paralog)預(yù)測
        2.3 進(jìn)化關(guān)系分析
        2.4 數(shù)據(jù)庫的實(shí)現(xiàn)
    3 結(jié)果與分析
        3.1 各個(gè)轉(zhuǎn)錄組的基本信息
        3.2 進(jìn)化分析結(jié)果
            3.2.1 物種進(jìn)化樹
        3.3 數(shù)據(jù)庫界面及操作
            3.3.1 數(shù)據(jù)瀏覽
            3.3.2 數(shù)據(jù)檢索
    4 討論
        4.1 昆蟲轉(zhuǎn)錄組的差異
        4.2 物種分化時(shí)間
第三章 利用RNAi技術(shù)培育抗二化螟水稻
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 水稻品種
        1.2 載體與菌株
        1.3 二化螟幼蟲
        1.4 miRNA抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻csu-15
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 二化螟總RNA的抽提及反轉(zhuǎn)錄
        2.2 候選靶標(biāo)片段的選擇
        2.3 干涉載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4 轉(zhuǎn)化植株的T₀代陽性檢測
        2.5 利用Southern blotting對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行拷貝數(shù)檢測
            2.5.1 植物基因組大量樣品抽提
            2.5.2 基因組DNA的檢測
            2.5.3 酶切和虹吸法轉(zhuǎn)膜印記
            2.5.4 預(yù)雜交
            2.5.5 標(biāo)探針、加探針
            2.5.6 洗膜及壓磷屏顯像
        2.6 轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)量檢測
        2.7 體外dsRNA的人工合成
        2.8 喂蟲試驗(yàn)
            2.8.1 人工飼料飼喂
            2.8.2 室內(nèi)幼苗飼喂
            2.8.3 室內(nèi)莖稈接蟲
                2.8.3.1 短期莖稈抗蟲鑒定
                2.8.3.2 二化螟全生育期連續(xù)喂食
        2.9 喂食csu-15材料的二化螟中腸組織差異表達(dá)分析
            2.9.1 二化螟中腸組織RNA分離及測序
            2.9.2 差異表達(dá)分析
            2.9.3 miRNA靶標(biāo)預(yù)測
    3 結(jié)果與分析
        3.1 dsRNA的合成
        3.2 dsRNA人工飼料飼喂試驗(yàn)結(jié)果
        3.3 轉(zhuǎn)化片段植株拷貝數(shù)檢測及表達(dá)量檢測
            3.3.1 植株拷貝數(shù)檢測
            3.3.2 植株表達(dá)量檢測
        3.4 室內(nèi)莖稈飼喂結(jié)果
        3.5 csu-15二化螟抗性鑒定及喂食后二化螟中腸差異表達(dá)分析
            3.5.1 csu-15轉(zhuǎn)基因植株對(duì)二化螟的抗性鑒定
            3.5.2 二化螟中腸差異表達(dá)分析
    4 討論
        4.1 RNAi抗蟲策略遇到的問題與解決思路
        4.2 dsRNA抗蟲與miRNA抗蟲的比較
第四章 水稻全長cDNA PET文庫構(gòu)建及分析
    1 試驗(yàn)材料
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 RNA抽提
        2.2 全長cDNA的獲得與文庫制備
        2.3 測序
        2.4 數(shù)據(jù)分析及評(píng)估
    3 結(jié)果與分析
        3.1 測序與TSS-PAS對(duì)提取結(jié)果
        3.2 兩個(gè)水稻數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果
            3.2.1 RAGP 7比對(duì)結(jié)果
            3.2.2 KOME比對(duì)結(jié)果
            3.2.3 可變的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)
    4 討論
        4.1 全長cDNA PET文庫構(gòu)建
        4.2 利用RAPG 7與KOME數(shù)據(jù)庫對(duì)本策略的評(píng)估
        4.3 與三代測序全長轉(zhuǎn)錄組的比較
參考文獻(xiàn)
附錄1 全長cDNA文庫構(gòu)建過程中涉及的自定義序列
致謝



本文編號(hào)：3784347