發(fā)布時(shí)間：2023-04-04 05:51

　　枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis),己成功應(yīng)用于多種植物病害的防治,是生防微生物的重要組成部分。B.subtilis 9407是本實(shí)驗(yàn)室從蘋果上分離獲得的有益芽胞桿菌,對(duì)蘋果輪紋病具有明顯的防治效果,應(yīng)用前景廣闊。本研究利用分析化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),探究了該菌株抑制蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)和瓜類細(xì)菌性果斑病菌Acidovorax citrulli)的主要抑菌物質(zhì)及其在生物防治中的作用、MecA在定殖和細(xì)菌性果斑病生物防治中的作用、MecA調(diào)控生物膜形成的途徑,不僅有利于揭示生防芽胞桿菌的防病機(jī)制,而且有助于探尋提高生防菌生防效果的新途徑。1.B.subtilis9407抑菌物質(zhì)fengycin對(duì)蘋果輪紋病生物防治作用。為深入研究該菌株的主要抑菌物質(zhì)及生防機(jī)制,本研究篩選了 14,300株隨機(jī)插入突變體,獲得34株對(duì)B.dothiddea抑菌能力發(fā)生顯著變化的突變體。通過Southern blot、反向PCR和測(cè)序分析確定突變體Q4-33(抑菌能力顯著降低)中,轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)為基因ppsB。本研究構(gòu)建ppsB缺失突變體△ppsB。抑菌活...

【文章頁數(shù)】：174 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 緒論
    1.1 枯草芽胞桿菌在植物病害生物防治中的應(yīng)用
        1.1.1 枯草芽胞桿菌
        1.1.2 枯草芽胞桿菌在植物病害生物防治中的應(yīng)用
        1.1.3 枯草芽胞桿菌在植物病害生物防治中存在的問題及對(duì)策
    1.2 枯草芽胞桿菌的生防作用機(jī)制
        1.2.1 拮抗作用
        1.2.2 競(jìng)爭(zhēng)作用
        1.2.3 溶菌作用
        1.2.4 誘導(dǎo)抗病性
    1.3 枯草芽胞桿菌脂肽類抗生素研究進(jìn)展
        1.3.1 脂肽類抗生素的分類及結(jié)構(gòu)
        1.3.2 脂肽類抗生素的生物合成機(jī)制及調(diào)控途徑
        1.3.3 脂肽類抗生素的生物學(xué)功能
    1.4 枯草芽胞桿菌生物膜研究進(jìn)展
        1.4.1 枯草芽胞桿菌生物膜生活史
        1.4.2 枯草芽胞桿菌生物膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)組分
        1.4.3 枯草芽胞桿菌生物膜形成過程中基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
        1.4.4 枯草芽胞桿菌生物膜形的起始
        1.4.5 枯草芽胞桿菌生物膜形的成熟與消解
        1.4.6 枯草芽胞桿菌生物膜在生物防治中的作用
    1.5 研究?jī)?nèi)容及目的意義
        1.5.1 研究?jī)?nèi)容
        1.5.2 研究目的與意義
第二章 B.subtilis 9407抑菌物質(zhì)fengycin對(duì)蘋果輪紋病生物防治作用研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 蘋果
        2.1.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        2.1.3 酶和引物合成
        2.1.4 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)溶液的配制
        2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.2 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.3 B.subtilis 9407菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊轉(zhuǎn)化
        2.2.4 B.subtilis菌株基因組DNA的提取
        2.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
        2.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收
        2.2.7 蘋果輪紋病菌孢子懸液的制備
        2.2.8 轉(zhuǎn)座子突變體庫的篩選
        2.2.9 Southern blot
        2.2.10 反向PCR和序列分析
        2.2.11 缺失重組載體的構(gòu)建
        2.2.12 目標(biāo)基因缺失突變體的構(gòu)建及篩選
        2.2.13 目標(biāo)基因缺失突變體的抑菌活性測(cè)定
        2.2.14 脂肽類抗生素粗提物的制備
        2.2.15 脂肽類抗生素粗提物的抑菌活性檢測(cè)
        2.2.16 薄層層析-生物自顯影(thin-layer chromatography Bioutography)
        2.2.17 RP-HPLC分析
        2.2.18 蘋果果實(shí)上的生防效果測(cè)定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 對(duì)蘋果輪紋病菌抑菌能力發(fā)生變化突變體的篩選
        2.3.2 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因的鑒定和分析
        2.3.3 ppsB缺失突變體的構(gòu)建
        2.3.4 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物對(duì)B.dothidea的抑制作用分析
        2.3.5 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物薄層層析-生物自顯影分析
        2.3.6 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物高效液相色譜分析
        2.3.7 B.subtilis 9407和△ppsB對(duì)蘋果果實(shí)上輪紋病的生防效果
    2.4 小結(jié)
    2.5 討論
第三章 B.subtilis 9407抑菌物質(zhì)surfactin對(duì)瓜類細(xì)菌性果斑病生物防治作用研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        3.1.2 酶和引物合成
        3.1.3 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)溶液的配制
        3.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.2 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
        3.2.3 B.subtilis 9407菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊轉(zhuǎn)化
        3.2.4 B.subtilis菌株基因組DNA的提取
        3.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
        3.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收
        3.2.7 srfAB突變載體pMAD-srfAB的構(gòu)建
        3.2.8 △srfAB的構(gòu)建及驗(yàn)證
        3.2.9 脂肽粗提物的制備
        3.2.10 RP-HPLC分析
        3.2.11 B.subtilis 9407拮抗活性測(cè)定
        3.2.12 溫室條件下對(duì)細(xì)菌性果斑病菌生防效果的測(cè)定
        3.2.13 生物膜形成能力檢測(cè)
        3.2.14 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)
        3.2.15 B.subtilis 9407、△srfAB標(biāo)記菌株的構(gòu)建
        3.2.16 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        3.2.17 B.subtilis 9407、△srfAB在甜瓜根部和葉部定殖能力測(cè)定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 B.subtilis 9407拮抗性的測(cè)定
        3.3.2 B.subtilis 9407對(duì)瓜類細(xì)菌性果斑病的生防效果測(cè)定
        3.3.3 △srfAB的構(gòu)建
        3.3.4 B.subtilis 9407、△srfAB生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        3.3.5 B.subtilis 9407、△srfAB脂肽粗提物高效液相色譜分析
        3.3.6 B.subtilis 9407、△ppsB、△srfAB抑菌能力的測(cè)定
        3.3.7 B.subtilis 9407、△srfAB的生物膜形成能力
        3.3.8 B.subtilis 9407、△srfAB的運(yùn)動(dòng)性
        3.3.9 B.subtilis 9407、△srfAB標(biāo)記菌株的構(gòu)建
        3.3.10 B.subtilis 9407(pC-1)和△srfAB(pC-1)生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        3.3.11 B.subtilis 9407(pC-1)、△srfAB(pC-1)在甜瓜根內(nèi)部和葉內(nèi)部的定殖能力
        3.3.12 B.subtilis 9407、△srfAB對(duì)甜瓜果斑病的生物防治效果測(cè)定
    3.4 小結(jié)
    3.5 討論
第四章 B.subtilis 9407 MecA對(duì)定殖和細(xì)菌性果斑病生物防治的作用
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        4.1.2 酶和引物合成
        4.1.3 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)溶液的配制
        4.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        4.2.2 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
        4.2.3 B.subtilis 9407菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊轉(zhuǎn)化
        4.2.4 B.subtilis菌株基因組DNA的提取
        4.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
        4.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收
        4.2.7 生物膜形成能力發(fā)生變化突變體篩選
        4.2.8 Southern blot
        4.2.9 反向PCR和序列分析
        4.2.10 缺失重組載體pMDE-mecA的構(gòu)建
        4.2.11 mecA缺失突變體的構(gòu)建及篩選驗(yàn)證
        4.2.12 功能互補(bǔ)載體的構(gòu)建
        4.2.13 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        4.2.14 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        4.2.15 生物膜形成能力檢測(cè)
        4.2.16 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)
        4.2.17 B.subtilis 9407、△mecA對(duì)細(xì)菌性果斑病的抑菌能力測(cè)定
        4.2.18 B.subtilis 9407、△mecA在甜瓜根部和葉部定殖能力測(cè)定
        4.2.19 溫室條件下B.subtilis 9407、△mecA對(duì)細(xì)菌性果斑病菌生防效果的測(cè)定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 B.subtilis 9407生物膜形成能力降低突變體的篩選
        4.3.2 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因的鑒定和分析
        4.3.3 隨機(jī)插入突變體的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        4.3.4 mecA缺失突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        4.3.5 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        4.3.6 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)生物膜形成能力檢測(cè)
        4.3.7 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)的運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)
        4.3.8 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)在甜瓜根部和葉部的定殖能力
        4.3.9 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)抑菌活性的分析
        4.3.10 9407(pBE2)、AmecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)對(duì)甜瓜果斑病的生物防治
    4.4 小結(jié)
    4.5 討論
第五章 B.subtilis 9407 MecA對(duì)生物膜形成調(diào)控途徑的分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        5.1.2 酶和引物合成
        5.1.3 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)溶液的配制
        5.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        5.2.2 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
        5.2.3 B.subtilis 9407菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊轉(zhuǎn)化
        5.2.4 B.subtilis菌株基因組DNA的提取
        5.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
        5.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收
        5.2.7 缺失重組載體的構(gòu)建
        5.2.8 缺失突變體的構(gòu)建及篩選驗(yàn)證
        5.2.9 功能互補(bǔ)載體的構(gòu)建
        5.2.10 功能互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        5.2.11 生物膜形成能力檢測(cè)
        5.2.12 promoter-lacZ同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.13 promoter-lacZ融合菌株的構(gòu)建
        5.2.14 β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 MecA影響B(tài).subtilis 9407生物膜基質(zhì)主要組分基因的表達(dá)
        5.3.2 MecA通過SpoOA-SinI-SinR途徑調(diào)控B.subtilis 9407生物膜形成
        5.3.3 MecA通過AbrB調(diào)控B.subtilis 9407生物膜形成
        5.3.4 MecA通過SinR調(diào)控B.subtilis 9407生物膜形成
        5.3.5 MecA及生物膜形成關(guān)鍵因子的序列分析
    5.4 小結(jié)
    5.5 討論
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 本研究的創(chuàng)新性
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3781906