在復(fù)雜的自然環(huán)境中,昆蟲通過其敏銳的化學(xué)通訊系統(tǒng)來識別所處環(huán)境中的各種化學(xué)信息物質(zhì),并作出反應(yīng)。在昆蟲化學(xué)感受系統(tǒng)中,往往存在著兩類酸性、低分子量的蛋白,即化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)和氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)。中華蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius(簡稱中蜂)善于采集零星蜜源,具有靈敏發(fā)達的化學(xué)感受系統(tǒng)。觸角是蜜蜂重要的化學(xué)通訊器官,因此研究中蜂觸角特異表達蛋白的生理功能,對于深入了解中蜂化學(xué)通訊識別機理具有重要的理論意義。此外,蜜蜂因受到新煙堿類殺蟲劑的高致毒性而引起廣泛關(guān)注。新煙堿殺蟲劑已被證實即使在亞致死劑量下仍能對蜜蜂嗅覺、化學(xué)感受和學(xué)習(xí)等行為產(chǎn)生嚴重的影響。因此,本研究在前期發(fā)現(xiàn)的幾個高豐度表達于工蜂觸角的CSPs和OBPs基因和配基結(jié)合功能基礎(chǔ)上,通過多重熒光光譜實驗及熱動力學(xué)分析它們與相應(yīng)天然配基以及新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉的結(jié)合特性,并用分子對接和定點突變技術(shù)鑒定了CSP1分別與β-紫羅蘭酮和吡蟲啉結(jié)合過程中的關(guān)鍵氨基酸殘基,并證實了在亞致死劑量下的吡蟲啉仍...

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
1 緒論
    1.1 蜜蜂概述
        1.1.1 蜜蜂生物學(xué)特性
        1.1.2 蜜蜂間的通訊
    1.2 昆蟲間嗅覺識別及相關(guān)蛋白概述
        1.2.1 氣味結(jié)合蛋白與化學(xué)感受蛋白簡介
        1.2.2 氣味結(jié)合蛋白與化學(xué)感受蛋白的研究進展
    1.3 生化結(jié)合及定點突變研究進展
        1.3.1 生化結(jié)合、分子互作研究進展
        1.3.2 定點突變研究進展
    1.4 研究背景、內(nèi)容和意義
        1.4.1 研究背景
        1.4.2 研究內(nèi)容
        1.4.3 研究意義
2 中華蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4的原核表達、蛋白純化及配基結(jié)合機理研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要實驗材料、試劑與儀器
        2.1.2 中華蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4表達載體的構(gòu)建
        2.1.3 中華蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重組蛋白的誘導(dǎo)表達
        2.1.4 中華蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重組蛋白的分離純化與復(fù)性
        2.1.5 中華蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4重組蛋白的結(jié)合機理分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 中華蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4蛋白誘導(dǎo)、純化
        2.2.2 熒光猝滅光譜分析
        2.2.3 猝滅機理及結(jié)合常數(shù)分析
        2.2.4 熱力學(xué)分析
        2.2.5 CSP1的紫外吸收光譜測定
        2.2.6 CSP1的同步熒光分析
        2.2.7 CSP1的圓二色 (CD)光譜分析
        2.2.8 分子對接
        2.2.9 吡蟲啉影響CSP1的功能分析
    2.3 討論
3 中蜂CSP1與β-紫羅蘭酮、吡蟲啉作用中關(guān)鍵氨基酸位點鑒定
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要實驗材料、試劑與儀器
        3.1.2 分子對接
        3.1.3 設(shè)計突變引物和定點突變
        3.1.4 突變蛋白誘導(dǎo)及熒光結(jié)合實驗
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 分子對接
        3.2.2 引物設(shè)計及突變結(jié)果
        3.2.3 突變蛋白誘導(dǎo)及熒光猝滅實驗
        3.2.4 CSP1突變蛋白與β-紫羅蘭酮的熱力學(xué)分析及分子對接
        3.2.5 CSP1突變蛋白與吡蟲啉的熒光猝滅實驗及熱力學(xué)分析
    3.3 討論
4 中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白ASP2的基因克隆及基因可變性分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要實驗材料、試劑與儀器
        4.1.2 中華蜜蜂觸角總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        4.1.3 中蜂ASP2的基因擴增、克隆及測序
        4.1.4 中蜂ASP2的基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 中華蜜蜂觸角總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及基因擴增克隆
        4.2.2 中華蜜蜂ASP2基因序列分析
        4.2.3 中蜂ASP2與意蜂ASP2比對及基因剪切情況
        4.2.4 中意蜂ASP2的分子對接
    4.3 討論
5 中蜂ASP2與β-紫羅蘭酮、吡蟲啉作用中關(guān)鍵氨基酸位點鑒定
    5.1 材料與方法
        5.1.1 主要實驗材料、試劑與儀器
        5.1.2 定點突變
        5.1.3 突變蛋白誘導(dǎo)及熒光結(jié)合實驗
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 定點突變及突變蛋白誘導(dǎo)
        5.2.2 野生型ASP2蛋白及突變型ASP2蛋白與β-紫羅蘭酮的熒光結(jié)合實驗及熱力學(xué)分析
        5.2.3 野生型ASP2蛋白及突變型ASP2蛋白與吡蟲啉的熒光結(jié)合實驗及熱力學(xué)分析
    5.3 討論
6 中華蜜蜂觸角的掃描電鏡與化學(xué)感受蛋白CSP1的亞細胞定位
    6.1 材料與方法
        6.1.1 主要實驗材料、試劑與儀器
        6.1.2 中華蜜蜂觸角的掃描電鏡
        6.1.3 中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白CSP1抗體的制備及效價測定
        6.1.4 中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白CSP1的亞細胞定位
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 中華蜜蜂觸角的掃描電鏡
        6.2.2 中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白CSP1抗體的制備及效價測定
        6.2.3 中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白CSP1的亞細胞定位
    6.3 討論
7 總結(jié)與展望
    7.1 研究總結(jié)
        7.1.1 中華蜜蜂CSP1、CSP2、CSP4的原核表達、蛋白純化及配基結(jié)合機理研究
        7.1.2 定點突變確定中蜂CSP1與β-紫羅蘭酮、吡蟲啉作用中關(guān)鍵氨基酸位點
        7.1.3 中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白ASP2的基因克隆及基因編輯分析
        7.1.4 定點突變確定中蜂ASP2與β-紫羅蘭酮、吡蟲啉作用中關(guān)鍵氨基酸位點
        7.1.5 中華蜜蜂觸角的掃描電鏡與化學(xué)感受蛋白CSP1的亞細胞定位
    7.2 課題展望
參考文獻
作者簡介



本文編號：3781186