甘蔗線條花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)禾草病毒屬(Poacevirus),是引起甘蔗花葉病的三種主要病原之一。SCSMV的P1蛋白能抑制單鏈RNA誘導(dǎo)的局部沉默,但尚不了解其能否抑制系統(tǒng)沉默和雙鏈RNA引起的局部沉默,以及其是否具有致病決定因子的功能。植物病毒編碼的抑制子蛋白的亞細(xì)胞定位,能夠顯著影響其RNA沉默抑制的活性,繼而調(diào)控病毒的致病性。本研究首先利用農(nóng)桿菌浸潤本氏煙的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)來確定P1蛋白的沉默抑制活性。將P1與ssGFP及含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsFP在本氏煙上混合注射,番茄叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)的抑制子P19作為陽性對照,空載體作為陰性對照。3天后在紫外燈下觀察注射葉片,發(fā)現(xiàn)P1注射區(qū)域與P19一樣有很強(qiáng)的綠色熒光,陰性對照基本無熒光,說明P1能抑制單鏈或雙鏈RNA誘導(dǎo)的局部沉默。Western blot檢測結(jié)果與觀察結(jié)果一致,P19與P1區(qū)域的GFP蛋白量明顯多于空載體。在16c轉(zhuǎn)基因本氏煙上混合注射P1和ssGFP來確定P1的系統(tǒng)沉...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
文獻(xiàn)綜述
    1 甘蔗線條花葉病毒
        1.1 分類地位
        1.2 寄主范圍及癥狀
        1.3 傳播途徑
        1.4 SCSMV的基因組結(jié)構(gòu)
    2 RNA沉默
        2.1 RNA沉默的發(fā)現(xiàn)
        2.2 RNA沉默的基本過程
        2.3 RNA沉默通路中的關(guān)鍵因子
    3.RNA沉默抑制子研究進(jìn)展
        3.1 結(jié)合長dsRNA抑制DCL切割
        3.2 結(jié)合雙鏈siRNA抑制RISC復(fù)合體的形成
        3.3 作用于RNA沉默通路的關(guān)鍵蛋白
    4.亞細(xì)胞定位對VSRs抑制能力及致病性的影響
        4.1 VSRs作為致病決定因子
        4.2 亞細(xì)胞定位對VSRs抑制活性的影響
        4.3 亞細(xì)胞定位對VSRs致病性的影響
    5 研究目的與意義
材料與方法
    1 材料
        1.1 植物材料與菌株
        1.2 主要質(zhì)粒載體
        1.3 酶和化學(xué)試劑
    2 試劑、溶液和培養(yǎng)基的配制
        2.1 常用試劑、溶液和培養(yǎng)基
        2.2 Western blot相關(guān)試劑
        2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 植物總RNA的提取
        3.2 反轉(zhuǎn)錄
        3.3 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))
        3.4 PCR產(chǎn)物的純化
        3.5 DNA片段與載體的連接
        3.6 Gateway反應(yīng)體系
        3.7 大腸桿菌DH5α感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        3.8 質(zhì)粒提取
        3.9 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        3.10 農(nóng)桿菌浸潤法介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)
        3.11 長波紫外燈下觀察與拍攝及激光共聚焦顯微鏡觀察
        3.12 Western blot檢測
        3.13 DAB染色
        3.14 臺(tái)盼藍(lán)染色
結(jié)果與分析
    1 P1蛋白的沉默抑制功能分析
        1.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2 P1蛋白的局部沉默抑制功能研究
        1.3 P1蛋白的系統(tǒng)沉默抑制功能研究
    2 P1蛋白對病毒致病性的影響
    3 P1蛋白的亞細(xì)胞定位
    4 P1蛋白核定位信號(hào)突變對其沉默抑制功能的影響
    5 P1蛋白核定位信號(hào)突變對病毒致病性的影響
討論
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號(hào)：3780039