黃瓜（Cucumis sativus L.）口感爽脆、用途廣泛,是一類以溫室栽培為主的蔬菜,生長狀況易受環(huán)境及土壤影響,霜霉病為黃瓜主要的易感病害之一。霜霉威（Propamocarb）為一類內(nèi)吸型殺菌劑,具有低毒性、半衰期短等特點(diǎn),防治霜霉病效果良好。然而噴施霜霉威容易引起黃瓜體內(nèi)霜霉威殘留過高,引發(fā)新的食品安全問題。因此,黃瓜低農(nóng)殘的相關(guān)研究對提升黃瓜的品質(zhì)和食用安全性意義重大。課題組前期通過對低農(nóng)藥殘留品系‘D0351’進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的測序,篩選得到了一個霜霉威脅迫下表達(dá)量明顯下降的CsDREB1。推測CsDREB1為調(diào)控黃瓜農(nóng)殘的重要轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控其他基因發(fā)揮作用。本文通過克隆、表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位等分子生物學(xué)。研究成果如下:（1）通過PCR技術(shù)成功克隆出CsDREB1的CDS序列,長度是603bp,編碼200個氨基酸,包含一段63個氨基酸組成的AP2結(jié)構(gòu)域,是AP2超級家族成員之一。（2）通過生物信息學(xué)方法預(yù)測該基因理論分子量22.26KD,屬于不穩(wěn)定親水蛋白,無明顯信號肽,無明顯跨膜區(qū)域。黃瓜CsDREB1與甜瓜CmDREB1D之間的親緣關(guān)系近,CsDREB1屬于DREB... 

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1.前言
    1.1 研究目的及意義
    1.2 研究內(nèi)容及研究路線
        1.2.1 主要研究內(nèi)容
        1.2.2 試驗(yàn)的技術(shù)路線圖
    1.3 國內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.3.1 蔬菜農(nóng)藥殘留
        1.3.2 霜霉威研究現(xiàn)狀
    1.4 AP2轉(zhuǎn)錄家族研究現(xiàn)狀
        1.4.1 AP2大家族的基本信息
        1.4.2 DREB轉(zhuǎn)錄因子亞族
        1.4.3 DREB抗逆性研究現(xiàn)狀
2.材料與方法
    2.1 試驗(yàn)種質(zhì)材料
    2.2 試驗(yàn)試劑及菌株
    2.3 克隆CSDREB1
        2.3.1 黃瓜果實(shí)RNA的提取和檢測
        2.3.2 合成cDNA的第一條鏈
        2.3.3 CsDREB1的克隆
        2.3.4 將CsDREB1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收
        2.3.5 與pEASY-T3載體的連接及陽性克隆篩選
    2.4 CSDREB1的序列分析
    2.5 CSDREB1的表達(dá)模式分析
    2.6 CSDREB1亞細(xì)胞定位分析
        2.6.1 構(gòu)建植物綠色熒光表達(dá)載體
        2.6.2 純化質(zhì)粒
        2.6.3 制備擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞
        2.6.4 CsDREB1-pGII-EGFP質(zhì)粒的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
    2.7 CsDREB1對擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.7.1 構(gòu)建CsDREB1植物過量表達(dá)載體
        2.7.2 重組質(zhì)粒向根癌農(nóng)桿菌的導(dǎo)入
    2.8 獲得CSDREB1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株
        2.8.1 獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因植株T0代種子
        2.8.2 獲得CsDREB1轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系
        2.8.3 分子鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥
        2.8.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥霜霉威下功能分析
    2.9 CSDREB1對黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.9.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)基
        2.9.2 轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的相關(guān)方法
        2.9.3 侵染外植體
        2.9.4 共培養(yǎng)并篩選培養(yǎng)外植體
        2.9.5 分化芽的生根培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因植株的馴化
        2.9.6 確認(rèn)轉(zhuǎn)基因黃瓜植株并收集黃瓜種子
3.結(jié)果與分析
    3.1 克隆CSDREB1
        3.1.1 提取黃瓜總RNA
        3.1.2 獲得CsDREB1全長并酶切驗(yàn)證
    3.2 CSDREB1的生物信息學(xué)分析
        3.2.1 CsDREB1的序列分析
        3.2.2 CsDREB1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
        3.2.3 分析CsDREB1的啟動子區(qū)域順式元件
    3.3 CSDREB1的表達(dá)模式分析
        3.3.1 CsDREB1在高農(nóng)殘品系‘D9320’和低農(nóng)殘品系‘D0351’中的表達(dá)分析
        3.3.2 CsDREB1不同時間中的表達(dá)分析
        3.3.3 CsDREB1不同器官中的表達(dá)分析
    3.4 CSDREB1編碼蛋白的亞細(xì)胞定位
        3.4.1 CsDREB1-pGII-EGFP融合表達(dá)載體的鑒定
        3.4.2 CsDREB1編碼蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的定位
    3.5 CSDREB1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的功能分析
        3.5.1構(gòu)建植物過量表達(dá)載體pBI121-CsDREB1
        3.5.2 植物過量表達(dá)載體35S-CsDREB1的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        3.5.3 T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選
        3.5.4 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因CsDREB1擬南芥植株
        3.5.5 過表達(dá)CsDREB1擬南芥的功能分析
    3.6 其他逆境脅迫下CSDREB1的表達(dá)分析
    3.7 黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化
        3.7.1 獲得CsDREB1轉(zhuǎn)基因黃瓜植株
        3.7.2 鑒定抗性黃瓜植株
4.討論
    4.1 CSDREB1序列分析
    4.2 CSDREB1的表達(dá)模式分析
    4.3 CSDREB1的亞細(xì)胞定位分析
    4.4 過表達(dá)CSDREB1擬南芥植株的抗性分析
    4.5 其他脅迫下CSDREB1的表達(dá)分析
    4.6 CSDREB1在黃瓜中的遺傳轉(zhuǎn)化
    4.7 本研究的創(chuàng)新和不足之處
        4.7.1 本研究的創(chuàng)新之處
        4.7.2 本研究的不足之處
5.結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]一種酶制劑對稻米農(nóng)殘的影響[J]. 姜心祿,李旭毅,池忠志,吳茂力,陳莉,鄭家國.  中國稻米. 2017(06)
[2]苦蕎轉(zhuǎn)錄因子基因FtDREB1和FtDREB2的克隆及其對非生物脅迫的應(yīng)答[J]. 劉為遠(yuǎn),劉桂男,陳雙,陳鍇劍,黃云吉,鄧仁榆,李成磊,吳琦.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2018(05)
[3]霜霉威在花椰菜上的消解動態(tài)及最終殘留研究[J]. 于福利,王玉萍,雷琪,王旭.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2017(07)
[4]農(nóng)藥的環(huán)境影響和健康危害:科學(xué)證據(jù)和減量控害建議[J]. 金書秦,方菁.  環(huán)境保護(hù). 2016(24)
[5]辣椒CaDREB3基因的克隆和表達(dá)特性分析[J]. 馮冬林,何水林,賴燕.  熱帶作物學(xué)報(bào). 2016(12)
[6]菊花DmDREBa/b基因提高轉(zhuǎn)基因煙草耐逆性研究[J]. 武劍,楊艷芳,王慧,朱凱,劉黎卿,陳發(fā)棣,喻德躍.  分子植物育種. 2016(11)
[7]霜霉威脅迫下黃瓜CsWRKY30表達(dá)及功能分析[J]. 李勝男,秦智偉,辛明,周秀艷.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2016(07)
[8]柑橘CitERF9和CitAP2-7在不同逆境和外源激素處理下的表達(dá)[J]. 董翠翠,馬巖巖,謝讓金,鄧烈,易時來,呂強(qiáng),鄭永強(qiáng),何紹蘭.  園藝學(xué)報(bào). 2016(02)
[9]農(nóng)藥殘留速測儀在蔬菜農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用[J]. 古力先·依達(dá)也提.  現(xiàn)代食品. 2016(05)
[10]梭梭中HaDREB2A的克隆與表達(dá)分析[J]. 劉超,馬麗,李月,代培紅,姚正培,張樺.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2015(09)

博士論文
[1]黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因CsDIR16的鑒定及功能分析[D]. 劉春紅.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]新疆野蘋果MsDREB6.2轉(zhuǎn)錄因子在干旱應(yīng)答中的作用機(jī)理研究[D]. 廖雄.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]黃瓜CsABC19和CsPDR響應(yīng)霜霉威脅迫的功能分析[D]. 孟晶晶.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]吉林省玉米種植區(qū)耕層土壤中莠去津和乙草胺殘留分布特征及風(fēng)險(xiǎn)評價[D]. 于曉斌.東北師范大學(xué) 2015
[5]黃瓜低霜霉威殘留性的生理生化及分子基礎(chǔ)研究[D]. 吳鵬.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[6]轉(zhuǎn)DREBIA基因和轉(zhuǎn)BADH-CMO基因多年生黑麥草矮化機(jī)理與抗逆性研究[D]. 包永霞.北京林業(yè)大學(xué) 2012
[7]我國蔬菜主產(chǎn)地形成及其經(jīng)濟(jì)效應(yīng)研究[D]. 呂超.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[8]棉花GhDREB1調(diào)節(jié)低溫抗性與生長發(fā)育的分子機(jī)理[D]. 黃金光.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[9]GmDREB5互作蛋白GmTPR1的功能分析及利用核蛋白篩選系統(tǒng)克隆抗逆基因[D]. 曹新有.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2009

碩士論文
[1]黃花苜蓿MfDREB1轉(zhuǎn)錄因子在提高轉(zhuǎn)基因煙草抗逆性中的作用研究[D]. 王歡.內(nèi)蒙古大學(xué) 2016
[2]黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因SDH的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 郭磊.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]小麥抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因DREB4A、W17轉(zhuǎn)化株系篩選及其抗旱性鑒定[D]. 普正菲.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016
[4]茉莉酸甲酯對水稻抗高溫的效應(yīng)[D]. 羅直文.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[5]霜霉威在辣椒中的消解動態(tài)和殘留規(guī)律及土壤中的光解研究[D]. 盧靜宜.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[6]不同桑樹雜交組合耐鹽耐旱性及MnDREB4A功能研究[D]. 劉雪琴.西南大學(xué) 2015
[7]大豆DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子GmDREB1A的克隆及功能鑒定[D]. 李艷杰.吉林大學(xué) 2014
[8]霜霉威在煙田中的殘留行為及效應(yīng)研究[D]. 唐晶.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[9]玉米DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子的克隆及其抗逆功能分析[D]. 周偉.吉林大學(xué) 2013
[10]將軍菊苣DREB家族基因的克隆、功能研究及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 趙龍.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號：3727966