微孢子蟲是細(xì)胞內(nèi)專性寄生的單細(xì)胞真核生物,能感染大部分脊椎、無(wú)脊椎動(dòng)物,其中家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）第一個(gè)被鑒定出來。N.bombycis是引起家蠶微粒子病的主要病原,由于其能經(jīng)食下和胚種傳染,經(jīng)常給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,影響蠶絲產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定,因此,N.bombycis被列為蠶種生產(chǎn)的唯一法定檢疫對(duì)象。母蛾鏡檢N.bombycis的方法是目前最主要的檢疫手段,但其準(zhǔn)確性受到多種因素影響。因此,建立一種簡(jiǎn)便、高效的N.bombycis檢測(cè)技術(shù),對(duì)于防治家蠶微粒子病起到關(guān)鍵作用。本文首先對(duì)傳統(tǒng)的熒光染色法進(jìn)行優(yōu)化,聯(lián)合應(yīng)用熒光增白劑28（FB28）和碘化丙啶（PI）2種熒光染色劑進(jìn)行N.bombycis孢子檢測(cè)。結(jié)果表明,成熟孢子被FB28染成藍(lán)色且細(xì)胞核被PI染成紅色,而未成熟的孢子只能被PI染色;在被感染的幼蟲中腸、蠶卵、母蛾、蟻蠶中都能夠檢測(cè)到N.bombycis孢子的存在,并且?guī)Ф灸付陿悠废♂? 000倍依然可以檢測(cè)到N.bombycis孢子。熒光顯微鏡下顯示被染色的N.bombycis孢子的細(xì)胞核明顯小于幼蟲中腸細(xì)胞核,且亮度明顯較強(qiáng),卵殼、母蛾、蟻蠶表... 

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 研究背景及意義
        1.1.1 研究背景
        1.1.2 研究意義
    1.2 微孢子蟲研究進(jìn)展
        1.2.1 微孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)與生活史
        1.2.2 微孢子蟲基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展
    1.3 微孢子蟲檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.1 染色法識(shí)別微孢子蟲
        1.3.2 免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)微孢子蟲
        1.3.3 分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)微孢子蟲
    1.4 納米金比色法
        1.4.1 納米金比色法檢測(cè)Hg~（2+）
        1.4.2 納米金比色法檢測(cè)核酸物質(zhì)
        1.4.3 納米金比色法檢測(cè)蛋白質(zhì)
    1.5 SAS-6蛋白質(zhì)研究進(jìn)展
        1.5.1 SAS-6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究
        1.5.2 SAS-6蛋白質(zhì)功能研究
    1.6 研究?jī)?nèi)容
第2章 應(yīng)用熒光染色劑Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide染色識(shí)別家蠶微孢子蟲
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病原物來源及供試家蠶品種
        2.1.2 感染幼蟲中腸、母蛾、卵、蟻蠶的獲取
        2.1.3 主要儀器和試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 幼蟲中腸樣品染色
        2.2.2 母蛾樣品染色
        2.2.3 蠶卵樣品染色
        2.2.4 蟻蠶樣品染色
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 感染家蠶幼蟲中腸的檢測(cè)效果
        2.3.2 感染母蛾的檢測(cè)效果
        2.3.3 感染蠶卵的檢測(cè)效果
        2.3.4 感染蟻蠶的檢測(cè)效果
    2.4 討論
第3章 納米金比色法與免疫技術(shù)結(jié)合檢測(cè)家蠶微孢子蟲
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 微孢子蟲
        3.1.2 主要儀器和試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 納米金(AuNPs)制備
        3.2.2 家蠶微孢子蟲總蛋白提取及其抗體制備
        3.2.3 抗體與AuNPs結(jié)合的最佳pH確定
        3.2.4 AuNPs與抗體結(jié)合的最佳濃度測(cè)定
        3.2.5 AuNPs探針制備
        3.2.6 納米金探針活性及其特異性測(cè)定
        3.2.7 納米金探針靈敏性測(cè)定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 AuNPs的制備
        3.3.2 N.bombycis總蛋白抗體制備
        3.3.3 最適標(biāo)記pH和最適抗體量
        3.3.4 AuNPs探針活性及其特異性測(cè)定
        3.3.5 AuNPs比色法靈敏性測(cè)定
    3.4 討論
第4章 納米金比色法與LAMP技術(shù)結(jié)合檢測(cè)家蠶微孢子蟲
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 蠶種
        4.1.2 微孢子蟲、細(xì)菌、真菌和病毒
        4.1.3 主要儀器和試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 FTA法提取微孢子蟲基因組
        4.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
        4.2.3 LAMP引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化
        4.2.4 納米金制備
        4.2.5 AuNP探針制備
        4.2.6 AuNP與LAMP產(chǎn)物雜交條件優(yōu)化
        4.2.7 比較LAMP-AuNP法和PCR法檢測(cè)的靈敏度
        4.2.8 LAMP-AuNP法特異性分析
        4.2.9 LAMP-AuNP法與PCR法檢測(cè)帶毒蠶卵
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化
        4.3.2 LAMP反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化
        4.3.3 LAMP反應(yīng)引物特異性分析
        4.3.4 LAMP產(chǎn)物與AuNP探針雜交比例優(yōu)化
        4.3.5 鹽濃度對(duì)比色實(shí)驗(yàn)影響
        4.3.6 LAMP-AuNP和PCR法靈敏度比較
        4.3.7 LAMP-AuNP法特異性檢測(cè)
        4.3.8 LAMP-AuNP法檢測(cè)帶毒蠶卵
    4.4 討論
第5章 家蠶微孢子蟲SAS-6蛋白鑒定及其定位研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 家蠶微孢子蟲
        5.1.2 主要儀器和試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.0 家蠶微孢子蟲DNA提取
        5.2.1 家蠶微孢子蟲SAS-6基因克隆
        5.2.2 NSAS-6蛋白氨基酸序列分析
        5.2.3 NSAS-6重組蛋白表達(dá)
        5.2.4 NSAS-6重組蛋白純化
        5.2.5 Western blot鑒定NSAS-6重組蛋白
        5.2.6 多克隆抗體制備及其效價(jià)檢測(cè)
        5.2.7 純化N.bombycis孢子
        5.2.8 家蠶微孢子蟲總蛋白及孢原質(zhì)蛋白提取
        5.2.9 Western blot檢測(cè)N.bombycis中NSAS-6蛋白
        5.2.10 N.bombycis接種BmN細(xì)胞
        5.2.11 NSAS-6蛋白亞細(xì)胞定位
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 NSAS-6基因克隆
        5.3.2 生物信息學(xué)分析
        5.3.3 NSAS-6重組蛋白表達(dá)及純化
        5.3.4 NSAS-6蛋白免疫印跡分析
        5.3.5 NSAS-6蛋白免疫定位
    5.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]應(yīng)用熒光染色劑Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide染色識(shí)別家蠶微孢子蟲[J]. 戴衛(wèi)江,陳功,彭祥然,李孝良,馬琳,唐旭東,徐莉,沈中元.  蠶業(yè)科學(xué). 2017(01)
[3]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)熊蜂中的微孢子蟲[J]. 郭禮強(qiáng),韓亮,張麗萍,田國(guó)寧,趙晗.  中國(guó)動(dòng)物檢疫. 2017(01)
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[5]基于EB1基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法檢測(cè)感染家蠶微粒子病的蠶卵[J]. 劉吉平,程偉,晏育偉,魏建影,楊吉龍.  昆蟲學(xué)報(bào). 2015(08)
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博士論文
[1]納米金比色法測(cè)定大分子分子量[D]. 凌凱.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 2013

碩士論文
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本文編號(hào)：3727319