葡萄（Vitis vinifera L.）是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的經(jīng)濟(jì)型水果,深受人們的喜愛(ài)。但葡萄易受病原真菌的侵染而發(fā)生病害,嚴(yán)重影響葡萄的品質(zhì)和產(chǎn)量。由葡萄座腔菌科真菌引發(fā)的葡萄潰瘍病（Botryosphaeria dieback）是危害葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害,其中可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）是造成該病害的主要病原真菌之一。效應(yīng)子（effector）是病原菌與植物互作過(guò)程中分泌的可以改變寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的蛋白分子,使病原菌容易定殖在寄主植物中發(fā)揮作用,但目前對(duì)L.theobromae效應(yīng)子的蛋白功能研究報(bào)道較少。旨在揭示L.theobromae對(duì)寄主葡萄的致病性,為植物病害的防治和抗病品種的選育提供思路,本文主要探究由L.theobromae釋放的有重要調(diào)控作用的效應(yīng)子LtCre1對(duì)葡萄的作用機(jī)理和L.theobromae特有效應(yīng)子LT₃97受逆境脅迫下的基因轉(zhuǎn)錄水平。主要研究結(jié)果如下:（1）利用酵母雙雜交技術(shù)預(yù)篩選L.theobromae效應(yīng)子LtCre1與葡萄cDNA文庫(kù)互作的候選蛋白,共有210余個(gè)候選蛋白既與效應(yīng)子... 

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 葡萄潰瘍病與可可毛色二孢菌的研究基礎(chǔ)
    1.2 植物防御系統(tǒng)研究進(jìn)展
        1.2.1 病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫PTI
        1.2.2 效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)ETI
        1.2.3 效應(yīng)子的作用機(jī)制
    1.3 病原菌-寄主的蛋白互作技術(shù)
        1.3.1 酵母雙雜交技術(shù)
        1.3.2 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)
        1.3.3 Pull down技術(shù)
        1.3.4 免疫共沉淀技術(shù)
    1.4 可可毛色二孢菌效應(yīng)子的研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的與意義
2 酵母雙雜交技術(shù)篩選可可毛色二孢菌效應(yīng)子LtCre1與葡萄互作的靶標(biāo)
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 供試培養(yǎng)基和其它試劑
        2.1.3 試驗(yàn)儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 誘餌載體的構(gòu)建
        2.2.2 酵母感受態(tài)制備
        2.2.3 誘餌載體質(zhì)粒向酵母的小量轉(zhuǎn)化
        2.2.4 酵母雙雜交預(yù)篩選
        2.2.5 酵母質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.6 酵母質(zhì)粒向大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化
        2.2.7 候選基因序列分析
        2.2.8 候選蛋白自激活驗(yàn)證
        2.2.9 候選蛋白回轉(zhuǎn)驗(yàn)證
        2.2.10 候選互作基因全長(zhǎng)的克隆與AD載體的構(gòu)建
        2.2.11 候選全長(zhǎng)蛋白自激活驗(yàn)證和回復(fù)驗(yàn)證
        2.2.12 候選蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 誘餌載體的驗(yàn)證
        2.3.2 誘餌載體的自激活及毒性分析
        2.3.3 酵母雙雜交預(yù)篩選分析
        2.3.4 候選蛋白基因序列分析
        2.3.5 候選蛋白自激活驗(yàn)證
        2.3.6 候選蛋白回轉(zhuǎn)驗(yàn)證
        2.3.7 候選互作基因AD載體的驗(yàn)證
        2.3.8 候選互作全長(zhǎng)蛋白的自激活和回復(fù)驗(yàn)證
        2.3.9 候選互作蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 效應(yīng)子LtCre1寄主靶標(biāo)的鑒定
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 供試菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 植物材料
        3.1.3 試驗(yàn)試劑
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 可可毛色二孢菌cDNA的制備
        3.2.2 葡萄cDNA的制備
        3.2.3 候選基因GFP載體的構(gòu)建
        3.2.4 候選基因和效應(yīng)基因LtCRE1 BiFC載體的構(gòu)建
        3.2.5 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
        3.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)
        3.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射接種
        3.2.8 效應(yīng)基因LtCRE1原核表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.9 候選基因EVvCIP2和VvCIP4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.10 目的蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.11 SDS聚丙稀酰胺電泳檢測(cè)蛋白
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 候選基因GFP載體的驗(yàn)證
        3.3.2 候選基因和效應(yīng)子基因BiFC載體的驗(yàn)證
        3.3.3 BiFC驗(yàn)證效應(yīng)子LtCre1 與候選蛋白Vv CIP2和Vv CIP4 互作
        3.3.4 p GEX-LtCre1 原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        3.3.5 候選蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        3.3.6 SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 可可毛色二孢菌效應(yīng)子LT_397基因的克隆及轉(zhuǎn)錄分析
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 試驗(yàn)材料
        4.1.2 供試培養(yǎng)基和其它試劑
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 效應(yīng)子LT_397基因的克隆
        4.2.2 效應(yīng)子LT_397的生物信息學(xué)分析
        4.2.3 效應(yīng)子LT_397毒力測(cè)定
        4.2.4 逆境脅迫下處理L.theobromae菌絲
        4.2.5 q RT-PCR檢測(cè)LT_397 基因的轉(zhuǎn)錄水平
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 LT_397基因的克隆及分析
        4.3.2 LT_397蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)與功能分析
        4.3.3 效應(yīng)子LT_397 可抑制B.glumae誘導(dǎo)的HR反應(yīng)
        4.3.4 L.theobromae不同侵染時(shí)間的LT_397 轉(zhuǎn)錄分析
        4.3.5 LT_397受逆境脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄分析
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
總結(jié)
展望
附錄A 溶液配制
附錄B 常見(jiàn)縮略詞
附錄C 載體圖譜
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物病原菌效應(yīng)子的研究進(jìn)展[J]. 楊曉倩,張立春,李奕文,王延偉.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2020(02)
[2]葡萄病害防治技術(shù)[J]. 劉海磊,劉建敏,劉國(guó)生,梁文凱,李衛(wèi)東.  河北農(nóng)業(yè). 2020(01)
[3]葡萄潰瘍病的發(fā)生危害及綜防技術(shù)探究[J]. 張玉榕,遲文娟.  時(shí)代農(nóng)機(jī). 2018(10)
[4]葡萄主要病害及其防治[J]. 白鳳珍.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2018(18)
[5]植物PTI天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展[J]. 楊俊,呂東平.  中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2018(10)
[6]葡萄病害綜合防治技術(shù)[J]. 王延俊.  農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2018(08)
[7]西藏一種芥菜型油菜PGIP基因的克隆與序列分析[J]. 龐博,劉何春.  植物保護(hù). 2018(02)
[8]葡萄主要病害防治要點(diǎn)[J]. 李學(xué)軍.  中國(guó)果菜. 2017(10)
[9]葡萄常見(jiàn)病害防治技術(shù)[J]. 趙慶久,明廣增.  植物醫(yī)生. 2017(06)
[10]尖孢鐮刀菌番茄專(zhuān)化型中APSES轉(zhuǎn)錄因子FolStuA的功能分析[J]. 周欣,云英子,郭譜勝,吳凱莉,陳偉鐘,李江江,周曉莉.  分子植物育種. 2018(03)

博士論文
[1]葡萄潰瘍病菌侵染葡萄的組學(xué)基礎(chǔ)與分子機(jī)制的初步研究[D]. 張瑋.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019

碩士論文
[1]中國(guó)葡萄主栽品種抗葡萄潰瘍病的研究[D]. 姚晟偉.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3714240