木霉菌（Trichoderma spp.）是一種應用前景廣闊的植物病害生物防治菌,生防潛力巨大,被廣泛應用于農(nóng)業(yè)和林業(yè)。對其生防機制進行了深入的研究。木霉菌不僅能抑制病原真菌,還能直接作用于寄主植物,刺激寄主植物對病原真菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。棘孢木霉分泌的木聚糖酶屬于糖基水解酶家族11（Glycosyl hydrolases family 11,GH11）,能夠刺激寄主植物對病原真菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性,被稱為新型植物誘導劑,具有很高的科研價值和廣闊的開發(fā)前景。在本研究中,克隆獲得棘孢木霉ACCC30536菌株的GH11家族中4個木聚糖酶基因（Xyn）。Xyn29.4有1個內(nèi)含子,有282aa,等電點為5.51,蛋白分子量為29.4kDa;Xyn24.2有1個內(nèi)含子,有223 aa,等電點為6.82,蛋白分子量為24.2kDa;Xyn24.4有1個內(nèi)含子,有230 aa,等電點為5.00,蛋白分子量為24.4 kDa;Xyn24.1有2個內(nèi)含子,有225 aa,等電點為5.25,蛋白分子量為24.1 kDa�；蚪Y構方面,GH11家族的所有Xyn基因可以分成4類,分別為Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ類,每類中的... 

【文章頁數(shù)】：127 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 木霉的研究概況
        1.1.1 木霉分類地位及特點
        1.1.2 木霉促進植物生長
        1.1.3 木霉與植物互作方式
        1.1.4 木霉誘導植物產(chǎn)生抗病性機制
    1.2 木聚糖酶的研究概況
        1.2.1 木聚糖酶基本性質(zhì)
        1.2.2 木聚糖酶的分類
        1.2.3 木聚糖酶的催化機制
        1.2.4 木聚糖酶誘導植物抗病性的研究
    1.3 畢赤酵母表達系統(tǒng)的研究概況
    1.4 山新楊的研究概況
    1.5 本文研究目的和意義
    1.6 研究內(nèi)容與技術路線
        1.6.1 研究內(nèi)容
        1.6.2 技術路線
2 棘孢木霉ACCC30536菌株木聚糖酶家族基因功能研究
    2.1 試驗材料
        2.1.1 供試試劑
        2.1.2 儀器及材料
        2.1.3 供試菌株和植物材料
        2.1.4 培養(yǎng)基
    2.2 研究方法
        2.2.1 棘孢木霉基因組木聚糖酶家族的生物信息學分析
        2.2.2 棘孢木霉ACCC30536菌株Xyn基因表達特性研究
    2.3 結果與分析
        2.3.1 木霉的木聚糖酶家族生物信息學分析
        2.3.2 棘孢木霉ACCC30536菌株Xyn基因的表達特性研究
        2.3.3 互作后木霉分生孢子RNA的提取
    2.4 關于棘孢木霉ACCC30536菌株木聚糖酶家族的基因功能研究的討論
        2.4.1 木聚糖酶家族的基因特性
        2.4.2 木聚糖酶家族的基因結構特性
        2.4.3 木聚糖酶家族的蛋白結構特性
        2.4.4 木霉與山新楊互作后提取木霉分生孢子RNA
        2.4.5 與山新楊互作后木霉的GH11家族的Xyn基因表達變化規(guī)律
    2.5 本章小結
3 GH11家族木聚糖酶基因Xyn29.4和Xyn24.2酵母表達
    3.1 試驗材料
        3.1.1 供試菌株及載體
        3.1.2 供試試劑
        3.1.3 培養(yǎng)基
    3.2 試驗方法
        3.2.1真核表達載體的選擇
        3.2.2 pPIC9K質(zhì)粒的提取
        3.2.3 木聚糖酶Xyn29.4和Xyn24.2基因的擴增
        3.2.4 重組表達載體pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的構建
        3.2.5 重組表達載體pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的檢測及保存
        3.2.6 重組表達載體pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115
        3.2.7 酵母重組轉(zhuǎn)化子GS115-Xyn29.4和GS115-Xyn24.2的誘導表達
        3.2.8 真核重組酶rXyn29.4和rXyn24.2的特性分析
    3.3 試驗結果
        3.3.1 重組表達載體pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2的構建及鑒定
        3.3.2 重組表達質(zhì)粒pPIC9K-Xyn29.4和pPIC9K-Xyn24.2轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115及篩選
        3.3.3 酵母重組轉(zhuǎn)化菌株GS115-Xyn29.4和GS115-Xyn24.2的誘導表達及純化
        3.3.4 重組木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2的酶活檢測
    3.4 關于Ⅰ型木聚糖酶和Ⅱ型木聚糖酶的真核表達的討論
        3.4.1 選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)
        3.4.2 構建木聚糖酶畢赤酵母工程菌株
        3.4.3 工程菌株分泌的重組木聚糖酶的SDS-PAGE電泳檢測
        3.4.4 工程菌株分泌的重組木聚糖酶的酶活性檢測
    3.5 本章小結
4 重組木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2促進山新楊生長特性
    4.1 試驗材料
        4.1.1 供試植物材料
        4.1.2 供試試劑
        4.1.3 供試儀器
    4.2 試驗方法
        4.2.1 重組木聚糖酶誘導山新楊組培苗
        4.2.2 重組木聚糖酶誘導后山新楊的生長指標
        4.2.3 重組木聚糖酶誘導后山新楊激素轉(zhuǎn)導途徑相關基因的RT-qPCR
        4.2.4 重組木聚糖酶誘導后山新楊的生理酶活性測定
        4.2.5 重組木聚糖酶誘導后山新楊的活性氧,細胞膜透性檢測
    4.3 實驗結果
        4.3.2 重組木聚糖酶對山新楊激素轉(zhuǎn)導途徑相關基因的影響
        4.3.3 重組木聚糖酶促進山新楊的生長
        4.3.4 重組木聚糖酶提高楊樹防御酶活性
        4.3.5 重組木聚糖酶增強山新楊葉片的抗活性氧能力以及細胞膜抗性
    4.4 關于重組木聚糖酶提高山新楊生理生長指標的討論
        4.4.1 重組木聚糖酶誘導的山新楊激素轉(zhuǎn)導途徑相關基因轉(zhuǎn)錄模式有明顯的變化
        4.4.2 重組木聚糖酶誘導的山新楊生長量增加
        4.4.3 重組木聚糖酶誘導的山新楊防御酶活性增加
        4.4.4 重組木聚糖酶誘導增強山新楊葉片的抗活性氧能力以及細胞膜抗性
    4.5 本章小結
5 重組木聚糖酶rXyn29.4和rXyn24.2誘導山新楊系統(tǒng)抗病性
    5.1 試驗材料
        5.1.1 組培苗及菌種
        5.1.2 供試試劑
        5.1.3 培養(yǎng)基
        5.1.4 供試儀器
    5.2 試驗方法
        5.2.1 重組木聚糖酶誘導山新楊土培苗
        5.2.2 重組木聚糖酶誘導后山新楊的離體葉片接種葉枯病病原鏈格孢菌
        5.2.3 重組木聚糖酶誘導后山新楊的整株接種立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌
        5.2.4 高效液相色譜法(HPLC)測定重組木聚糖酶誘導后山新楊葉部茉莉酸含量
        5.2.5 木聚糖通過茉莉酸途徑局部誘導山新楊抗尖孢鐮刀菌
    5.3 試驗結果
        5.3.1 重組木聚糖酶誘導后山新楊離體葉片接種葉枯病病原鏈格孢菌
        5.3.2 重組木聚糖酶誘導后山新楊整株接種立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌
        5.3.3 山新楊葉片中茉莉酸含量變化
        5.3.4 重組木聚糖酶局部誘導山新楊系統(tǒng)抗病性
        5.3.5 重組木聚糖酶通過茉莉酸途徑誘導山新楊系統(tǒng)抗病性
        5.3.6 重組木聚糖酶誘導山新楊系統(tǒng)抗病性機制模式圖
    5.4 關于對重組木聚糖酶誘導山新楊產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的討論
        5.4.1 重組木聚糖酶誘導增強山新楊抗葉枯病病原鏈格孢菌能力
        5.4.2 重組木聚糖酶誘導增強山新楊抗立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌能力
        5.4.3 重組木聚糖酶誘導后山新楊茉莉酸變化
        5.4.4 利用分根系統(tǒng)研究重組木聚糖酶局部或系統(tǒng)誘導山新楊抗病性
    5.5 本章小結
結論
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝
附件



本文編號：3707841