革蘭氏陰性致病細(xì)菌進(jìn)化了一系列不同的分泌系統(tǒng),如跨越細(xì)胞內(nèi)膜和外膜的Ⅱ型（T2SS）、Ⅲ型（T3SS）和Ⅳ型（T4SS）等分泌系統(tǒng),這些分泌系統(tǒng)將致病因子轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞引起病害。細(xì)菌內(nèi)外膜之間的周質(zhì)空間含有嚴(yán)密的肽聚糖（PG）層,它使細(xì)胞能承受膨壓而維持完整性及特定形狀。但是,PG層也成了阻礙分泌系統(tǒng)跨膜組裝的屏障。因此,PG層需通過其裂解酶局部重組,為分泌系統(tǒng)的組裝提供空間和受體位點(diǎn)。細(xì)菌含有三類主要的PG裂解酶,一類是切割肽聚糖骨架中的糖苷鍵的糖苷酶,第二類是切割肽聚糖側(cè)鏈的酰胺酶,第三類是切割側(cè)鏈中的肽鏈的內(nèi)切酶。后兩類酶對分泌系統(tǒng)的作用還毫無知曉。十字花科黑腐病菌（Xanthomonascampestrispv.campestris,Xcc）的野生型菌株8004含有4種切割肽聚糖側(cè)鏈的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶,根據(jù)它們與大腸桿菌酰胺酶在序列上的同源性和結(jié)構(gòu)上的相似性,命名為AmiC1,AmiC2,AmpD和AmiD。本研究對它們在細(xì)胞分裂和致病性中的作用進(jìn)行了研究。構(gòu)建了 amiC1、amiC2、ampD、amiD基因的突變體amiC1::pK18、△amiC2、△am... 

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮寫說明
第一章 前言
    1.1 植物病原細(xì)菌概述
    1.2 黃單胞菌屬概述
        1.2.1 黃單胞菌屬簡介
        1.2.2 黃單胞菌屬的致病因子
        1.2.3 黃單胞菌屬致病系統(tǒng)
    1.3 細(xì)菌分泌系統(tǒng)概述
        1.3.1 Ⅰ型分泌系統(tǒng)
        1.3.2 Ⅱ型分泌系統(tǒng)
        1.3.3 Ⅲ型分泌系統(tǒng)
        1.3.4 Ⅳ型分泌系統(tǒng)
        1.3.5 Ⅴ型分泌系統(tǒng)
        1.3.6 Ⅵ型分泌系統(tǒng)
        1.3.7 Ⅶ型分泌系統(tǒng)
        1.3.8 Sec分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)
        1.3.9 Tat蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)
    1.4 細(xì)菌細(xì)胞壁概述
    1.5 細(xì)菌肽聚糖裂解酶的概述
        1.5.1 裂解性糖基轉(zhuǎn)移酶的概述
        1.5.2 肽聚糖內(nèi)切酶的概述
        1.5.3 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的概述
    1.6 LytM家族的研究進(jìn)展
        1.6.1 NlpD脂蛋白的研究進(jìn)展
        1.6.2 EnvC蛋白的研究進(jìn)展
    1.7 肽聚糖裂解酶影響分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.8 十字花科黑腐病菌概述
    1.9 十字花科黑腐病菌重要致病基因的研究進(jìn)展
    1.10 研究的目的和意義
第二章 材料和方法
    2.1 菌株
    2.2 質(zhì)粒
    2.3 菌株的培養(yǎng)條件和方法
    2.4 總DNA的提取
    2.5 質(zhì)粒的提取
    2.6 PCR反應(yīng)
    2.7 DNA的純化
    2.8 瓊脂糖凝膠電泳
    2.9 酶切反應(yīng)
    2.10 連接反應(yīng)
    2.11 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制作
    2.12 轉(zhuǎn)化
    2.13 陽性克隆的驗(yàn)證
        2.13.1 菌裂解PCR驗(yàn)證
        2.13.2 酶切驗(yàn)證
    2.14 三親本接合
    2.15 點(diǎn)突變構(gòu)建策略和方法
    2.16 致病性的檢測
    2.17 過敏反應(yīng)的檢測
        2.17.1 定性過敏反應(yīng)的檢測
        2.17.2 定量過敏反應(yīng)的檢測
    2.18 5'RACE確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
    2.19 顯微鏡觀察
    2.20 胞外酶的檢測
        2.20.1 胞外蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶的平板檢測
        2.20.2 胞外蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶的定量檢測
    2.21 胞外多糖的檢測
    2.22 運(yùn)動(dòng)性的檢測
    2.23 生物膜的檢測
    2.24 蛋白的表達(dá)
    2.25 蛋白的純化(6×His標(biāo)簽)
    2.26 肽聚糖的提取
    2.27 肽聚糖與Remazol brilliant blue(RBB)標(biāo)記
    2.28 肽聚糖結(jié)合試驗(yàn)
    2.29 肽聚糖降解試驗(yàn)
    2.30 SDS-PAGE凝膠電泳
    2.31 蛋白定量
    2.32 Western blotting
        2.32.1 試劑耗材的準(zhǔn)備
        2.32.2 所需溶液
        2.32.3 具體操作
    2.33 細(xì)菌亞細(xì)胞定位蛋白的提取
        2.33.1 細(xì)菌總蛋白的提取
        2.33.2 細(xì)菌外膜蛋白和內(nèi)膜蛋白的提取
        2.33.3 細(xì)菌周質(zhì)蛋白的提取
        2.33.4 細(xì)菌胞外蛋白的提取
    2.34 GUS酶活的測定
第三章 Xcc編碼N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因突變體及互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 生物信息學(xué)分析Xcc 8004中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因
    3.3 amiD和ampD缺失突變體的構(gòu)建
    3.4 amiC相關(guān)突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
    3.5 小結(jié)
第四章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因?qū)?xì)胞分裂和致病性等的影響分析
    4.1 引言
    4.2 AmiC1是Xcc細(xì)胞分裂所必需的,AmiC2起一定的作用
    4.3 AmiC1影響Xcc的致病性
    4.4 AmiC1影響Xcc在非寄主上的HR
    4.5 AmiC1、AmiC2不影響胞外酶但AmiC1影響EPS產(chǎn)量
    4.6 AmiC1影響游動(dòng)性
    4.7 小結(jié)
第五章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶AmiC1需要潛在激活子的激活
    5.1 引言
    5.2 AmiC1的E335D點(diǎn)突變互補(bǔ)分析
    5.3 帶6個(gè)組氨酸且去掉信號肽區(qū)的AmiC蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建
    5.4 體外檢測His_6-AmiC1_(LN32)具有微弱的降解肽聚糖的活性
    5.5 小結(jié)
第六章 Xcc LytM家族蛋白NlpD和EnvC對細(xì)胞分裂和致病性等的影響分析
    6.1 引言
    6.2 LytM家族的生物信息學(xué)分析
    6.3 從突變體庫中獲得含有LytM結(jié)構(gòu)域基因的突變體
    6.4 LytM結(jié)構(gòu)域的突變體中nlpD和envC突變體影響細(xì)胞分裂
    6.5 LytM結(jié)構(gòu)域的突變體中nlpD突變體顯著影響致病
    6.6 生物信息學(xué)分析Xcc 8004中的EnvC和NlpD
        6.6.1 生物信息學(xué)分析Xcc 8004中的EnvC
        6.6.2 生物信息學(xué)分析Xcc 8004中的N1pD
        6.6.3 Xcc 8004的nlpD基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定以及啟動(dòng)子分析
    6.7 Xcc 8004中envC、nlpD缺失突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        6.7.1 envC缺失突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        6.7.2 nlpD缺失突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
    6.8 envC和nlpD的突變表型分析
        6.8.1 envC和nlpD缺失突變體在NYG和MMX上的生長
        6.8.2 envC和nlpD缺失突變體影響細(xì)胞分裂
        6.8.3 nlpD缺失突變體顯著影響致病性
        6.8.4 nlpD缺失突變體顯著影響HR
        6.8.5 envC缺失突變體不影響HR
        6.8.6 EnvC和NlpD不影響Ⅱ型胞外酶,但NlpD影響EPS的合成
        6.8.7 envC和nlpD缺失突變體影響游動(dòng)性
        6.8.8 nlpD缺失突變體影響細(xì)胞聚集
        6.8.9 nlpD缺失突變體對Zn~(2+)敏感
        6.8.10 nlpD缺失突變體對pH敏感
    6.9 小結(jié)
第七章 Xcc通過NlpD激活A(yù)miC1影響細(xì)胞分裂和致病性
    7.1 引言
    7.2 Xcc中NlpD的亞細(xì)胞定位
        7.2.1 Xcc 8004在基因組上NlpD融合3×Flag標(biāo)簽的菌株構(gòu)建
        7.2.2 Xcc的NlpD分布在細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)和外膜
    7.3 帶6個(gè)組氨酸標(biāo)簽且去掉信號肽區(qū)的NlpD和EnvC蛋白的表達(dá)純化
    7.4 His_6-NlpDLN22能在體外結(jié)合肽聚糖
    7.5 His_6-NlpDN22能在體外增強(qiáng)HiS6-AmiC1_(LN32)降解肽聚糖的活性
    7.6 AmiC1及其激活子NlpD影響致病性的機(jī)制研究
        7.6.1 NlpD/EnvC/AmiC不影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)hrp基因的表達(dá)
        7.6.2 NlpD/AmiC1影響Ⅲ型效應(yīng)物XC3176的分泌
    7.7 小結(jié)
第八章 結(jié)論與討論
    8.1 Xcc的AmiC/NlpD/EnvC參與細(xì)胞分裂
    8.2 Xcc的AmiC1/NlpD參與致病性
    8.3 Xcc的AmiC1降解肽聚糖的活性需要LytM家族調(diào)控蛋白NlpD的激活
    8.4 AmiC1/NlpD影響Xcc的Ⅲ型分泌系統(tǒng),但不影響Ⅱ分泌系統(tǒng)
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3679464