上個(gè)世紀(jì)末,本實(shí)驗(yàn)室在我國山東冬小麥上鑒定了一種由禾谷多粘菌傳播的新病毒,命名為中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）,它能引起小麥花葉病,導(dǎo)致小麥（Triticumaestivum）嚴(yán)重減產(chǎn)。盡管目前在CWMV的生物學(xué)和分子生物學(xué)有了明顯的進(jìn)展,但在其反向遺傳學(xué)及其與宿主相互作用等領(lǐng)域尚存在大量的研究空白。熱休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）是生物體內(nèi)高度保守的一種分子伴侶蛋白,在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用,也是參與多種病毒侵染過程的重要因子。因此,本研究首先圍繞CWMVcDNA克隆構(gòu)建及其侵染活性進(jìn)行了探索,然后基于CWMV侵染性克隆分析了 CWMV與宿主HSP70的互作關(guān)系,并取得了以下結(jié)果:首先,構(gòu)建了 T7啟動(dòng)子控制下的CWMV全長cDNA克隆,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、摩擦接種小麥后通過Northern blot、Western blot、電鏡觀察、癥狀等實(shí)驗(yàn),分析了該克隆的侵染活性。在此基礎(chǔ)上,又構(gòu)建了 35S啟動(dòng)子控制下的CWMV全長cDNA克隆雙元載體,并采用農(nóng)桿菌浸潤法接種本氏煙,實(shí)驗(yàn)分析表明該克隆能... 

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 中國小麥花葉病毒(CWMV)的研究概況
        1.1.1 CWMV田間癥狀
        1.1.2 CWMV基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.3 CWMV編碼的蛋白
            1.1.3.1 病毒復(fù)制酶(Viral Replicase)
            1.1.3.2 運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)
            1.1.3.3 外殼蛋白及其相關(guān)蛋白
            1.1.3.4 富含半胱氨酸蛋白(CRP)
        1.1.4 CWMV sRNA
    1.2 熱休克蛋白HSP70研究概況
        1.2.1 HSP70結(jié)構(gòu)
        1.2.2 HSP70的功能
        1.2.3 HSP70與病毒侵染
            1.2.3.1 HSP70對(duì)病毒復(fù)制的影響
            1.2.3.2 HSP70對(duì)病毒運(yùn)動(dòng)的影響
    1.3 本文研究的目的與意義
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基、儀器等
    2.2 實(shí)驗(yàn)的方法
        2.2.1 目的基因的克隆
            2.2.1.1 基因PCR擴(kuò)增
            2.2.1.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與回收純化
        2.2.2 構(gòu)建載體
            2.2.2.1 將目的片段連接克隆載體
            2.2.2.2 質(zhì)粒或者連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌
            2.2.2.3 鑒定陽性克隆、測(cè)序
            2.2.2.4 提取大腸桿菌的質(zhì)粒
            2.2.2.5 將載體進(jìn)行雙酶切
        2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母菌株中
        2.2.4 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種
        2.2.5 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.6 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中
        2.2.7 農(nóng)桿菌浸潤接種
        2.2.8 Quercetin處理
        2.2.9 熒光觀察
        2.2.10 Western blot
        2.2.11 提取Total RNA
        2.2.12 Northern blot
        2.2.13 病毒粒子提取
        2.2.14 電鏡觀察
        2.2.15 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.2.16 誘導(dǎo)目的蛋白原核表達(dá)
        2.2.17 熒光定量PCR
        2.2.18 植物細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核提取
        2.2.19 細(xì)胞膜蛋白提取
第3章 中國小麥花葉病毒(CWMV)全長侵染性克隆的構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
            3.2.2.1 引物設(shè)計(jì)
            3.2.2.2 病毒分離和病毒粒子的提取
            3.2.2.3 目的基因的擴(kuò)增及純化
            3.2.2.4 重組載體的構(gòu)建
            3.2.2.5 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            3.2.2.6 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種
            3.2.2.7 重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            3.2.2.8 農(nóng)桿菌浸潤接種
            3.2.2.9 病毒粒子電鏡觀察
            3.2.2.10 Western blot
            3.2.2.11 Northern blot
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 全長CWMV cDNA擴(kuò)增與克隆
        3.3.2 CWMV cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄及其侵染性分析
        3.3.3 農(nóng)桿菌浸潤法接種CWMV侵染性克隆
        3.3.4 應(yīng)用全長侵染性克隆分析CWMV溫敏性
    3.4 小結(jié)與討論
第4章 HSP70表達(dá)特性與CWMV侵染之間的關(guān)系分析
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
            4.2.2.1 設(shè)計(jì)引物
            4.2.2.2 Trizol法提取植物RNA
            4.2.2.3 擴(kuò)增目的基因及純化
            4.2.2.4 克隆載體的構(gòu)建
            4.2.2.5 基因沉默載體TRV:NbHSP70的構(gòu)建
            4.2.2.6 瞬時(shí)過表達(dá)載體35S:NbHSP70和35S:TaHSP70構(gòu)建
            4.2.2.7 Northern blot
            4.2.2.8 Western blot
            4.2.2.9 熒光定量PCR
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 CWMV侵染對(duì)宿主HSP70蛋白積累水平的影響
        4.3.2 抑制HSP70蛋白的積累對(duì)CWMV復(fù)制的影響
        4.3.3 CWMV侵染對(duì)HSP70的轉(zhuǎn)錄水平的影響
        4.3.4 沉默NbHSP70對(duì)CWMV復(fù)制的影響
        4.3.5 TaHSP70和NbHSP70過表達(dá)對(duì)CWMV的復(fù)制的影響
        4.3.6 NbHSP70對(duì)CWMV的RNA1復(fù)制的影響
    4.4 小結(jié)與討論
第5章 HSP70和CWMV復(fù)制酶的互作分析
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 方法
            5.2.2.1 引物設(shè)計(jì)
            5.2.2.2 擴(kuò)增與純化目的基因
            5.2.2.3 構(gòu)建重組載體
            5.2.2.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)
            5.2.2.5 農(nóng)桿菌浸潤接種
            5.2.2.6 熒光觀察
            5.2.2.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株
            5.2.2.8 ELISA實(shí)驗(yàn)
            5.2.2.9 Western blot
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 HSP70和CWMV復(fù)制酶的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)分析
        5.3.2 基于ELISA的體外互作分析
            5.3.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            5.3.2.2 pGEX-Rep~(1-333)、pET-HSP70蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
            5.3.2.3 ELISA-based binding assays
        5.3.3 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)BiFC
        5.3.4 NbHSP70和TaHSP70的定位分析
        5.3.5 HSP70與CWMV復(fù)制酶的細(xì)胞定位分析
    5.4 小結(jié)與討論
第6章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3647277