由荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.）引起的霜疫病是我國(guó)荔枝生產(chǎn)過(guò)程中為害最嚴(yán)重的病害。該病原菌隸屬卵菌,為二倍體生物且在遺傳進(jìn)化上與真菌的親緣關(guān)系甚遠(yuǎn),致使用于防治真菌病害的廣譜性殺菌劑對(duì)其防治效果不佳,且先前的基因敲除技術(shù)不適于研究其功能基因。本研究基于聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)與外源雙鏈RNA（double-stranded RNA,dsRNA）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默策略對(duì)荔枝霜疫霉M90與MAPK10兩個(gè)基因在病原菌生活史和致病性方面的作用與功能進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下:1.通過(guò)對(duì)荔枝霜疫霉全基因組進(jìn)行分析,篩選到一個(gè)與致病疫霉（Phytophthora infestans）RNA結(jié)合蛋白M90相似度達(dá)73%的同源蛋白,將其命名為Peronophythora litchii M90（PlM90）。對(duì)荔枝霜疫霉M90蛋白與致病疫霉、大豆疫霉（Phytophthora sojae）、擬南芥霜霉（Hyaloperonospora arabidopsidis）、向日葵霜霉（Pl... 

【文章來(lái)源】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞及中英文對(duì)照
第一章 前言
    1.1 荔枝霜疫病的研究概況
        1.1.1 荔枝的經(jīng)濟(jì)意義
        1.1.2 荔枝霜疫病的危害
        1.1.3 荔枝霜疫霉的分類(lèi)地位與生物學(xué)特性
        1.1.4 荔枝霜疫霉的生活史與田間發(fā)生流行規(guī)律
        1.1.5 荔枝霜疫病的防治研究
            1.1.5.1 農(nóng)業(yè)防治
            1.1.5.2 化學(xué)防治
            1.1.5.3 生物防治
    1.2 RNA結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展
        1.2.1 RNA結(jié)合蛋白概述
        1.2.2 RNA結(jié)合蛋白在動(dòng)物中的研究進(jìn)展
        1.2.3 RNA結(jié)合蛋白在植物中的研究進(jìn)展
        1.2.4 RNA結(jié)合蛋白在真菌中的研究進(jìn)展
        1.2.5 RNA結(jié)合蛋白在卵菌中的研究進(jìn)展
    1.3 促有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的研究進(jìn)展
        1.3.1 MAPK概述
        1.3.2 MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)
        1.3.3 MAPK信號(hào)通路在真菌中的研究進(jìn)展
            1.3.3.1 性激素應(yīng)答信號(hào)通路的研究進(jìn)展
            1.3.3.2 細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路的研究進(jìn)展
            1.3.3.3 高滲透壓調(diào)節(jié)信號(hào)通路的研究進(jìn)展
        1.3.4 MAPK信號(hào)通路在卵菌中的研究進(jìn)展
    1.4 RNA干擾技術(shù)在基因功能研究方面的研究進(jìn)展
        1.4.1 RNA干擾技術(shù)概述
        1.4.2 RNA干擾技術(shù)的發(fā)現(xiàn)
        1.4.3 RNA干擾技術(shù)的機(jī)制
        1.4.4 RNA干擾技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用
            1.4.4.1 RNA干擾技術(shù)在控制動(dòng)物疾病研究中的應(yīng)用
            1.4.4.2 RNA干擾技術(shù)在植物基因功能研究中的應(yīng)用
            1.4.4.3 RNA干擾技術(shù)在真菌基因功能研究中的應(yīng)用
            1.4.4.4 RNA干擾技術(shù)在卵菌基因功能研究中的應(yīng)用
    1.5 聚乙二醇介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)在基因功能研究方面的研究進(jìn)展
        1.5.1 PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.5.2 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)在高等植物遺傳轉(zhuǎn)化中的研究進(jìn)展
        1.5.3 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)在真菌遺傳轉(zhuǎn)化中的研究進(jìn)展
    1.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究進(jìn)展
        1.6.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述
        1.6.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)與方法
        1.6.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的運(yùn)用
        1.6.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在木本植物研究中的運(yùn)用
        1.6.5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在環(huán)境微生物研究中的運(yùn)用
    1.7 研究目的與意義
第二章 荔枝霜疫霉M90基因的克隆與功能分析
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 供試材料
            2.2.1.1 供試菌株與載體
            2.2.1.2 主要供試培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化試劑配方
            2.2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.2.2 試驗(yàn)方法
            2.2.2.1 荔枝霜疫霉的分離
            2.2.2.2 荔枝霜疫霉的純化
            2.2.2.3 荔枝霜疫霉的保存
            2.2.2.4 PlM90基因的同源比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析
            2.2.2.5 PlM90基因的轉(zhuǎn)錄模式分析
            2.2.2.6 沉默載體pHAM34::PlM90的構(gòu)建
            2.2.2.7 荔枝霜疫霉原生質(zhì)體的制備及PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
            2.2.2.8 PlM90基因沉默轉(zhuǎn)化子的篩選及驗(yàn)證
            2.2.2.9 PlM90基因沉默轉(zhuǎn)化子的表型分析
            2.2.2.10 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA樣品的準(zhǔn)備、提取與檢測(cè)
            2.2.2.11 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 PlM90基因編碼一個(gè)Puf家族中的RNA結(jié)合蛋白
        2.3.2 PlM90基因的生活史階段與侵染階段的轉(zhuǎn)錄模式
        2.3.3 PlM90基因沉默載體的構(gòu)建
            2.3.3.1 荔枝霜疫霉基因組的提取及目的基因PlM90的克隆
            2.3.3.2 pHAM34::PlM90沉默載體的構(gòu)建
        2.3.4 PlM90基因沉默轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.3.5 PlM90基因沉默轉(zhuǎn)化子的表型分析
            2.3.5.1 PlM90基因的沉默影響菌絲生長(zhǎng)速率
            2.3.5.2 PlM90基因的沉默影響游動(dòng)孢子的釋放而不影響孢子囊的產(chǎn)量
            2.3.5.3 PlM90基因的沉默影響游動(dòng)孢子的休止而不影響休止孢的萌發(fā)
            2.3.5.4 PlM90基因的沉默嚴(yán)重影響卵孢子的產(chǎn)量
            2.3.5.5 PlM90基因的沉默不影響致病性
        2.3.6 PlM90基因沉默轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)錄組分析
            2.3.6.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果參數(shù)
            2.3.6.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析
            2.3.6.3 荔轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)差異
            2.3.6.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析
            2.3.6.5 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析
    2.4 小結(jié)
第三章 荔枝霜疫霉MAPK10基因的克隆與功能分析
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 供試材料
            3.2.1.1 供試菌株與載體
            3.2.1.2 主要供試培養(yǎng)基及主要試劑配方
            3.2.1.3 主要儀器設(shè)備
            3.2.1.4 其他實(shí)驗(yàn)器具
        3.2.2 試驗(yàn)方法
            3.2.2.1 PlMAPK10基因的同源比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析
            3.2.2.2 PlMAPK10基因轉(zhuǎn)錄模式的分析
            3.2.2.3 沉默載體p TORmRFP4::PlMAPK10的構(gòu)建
            3.2.2.4 荔枝霜疫霉原生質(zhì)體的制備及聚乙二醇PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
            3.2.2.5 PlMAPK10基因沉默轉(zhuǎn)化子的篩選及驗(yàn)證
            3.2.2.6 PlMAPK10基因沉默轉(zhuǎn)化子的表型分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 PlMAPK10基因編碼一個(gè)促有絲分裂原活化蛋白激酶MAPK
        3.3.2 PlMAPK10基因在無(wú)性發(fā)育階段與侵染階段的轉(zhuǎn)錄模式
        3.3.3 PlMAPK10基因沉默載體的構(gòu)建
            3.3.3.1 荔枝霜疫霉基因組的提取及目的基因PlMAPK10的克隆
            3.3.3.2 沉默載體p TORmRFP4::PlMAPK10的構(gòu)建
        3.3.4 PlMAPK10基因沉默轉(zhuǎn)化子的獲得
        3.3.5 PlMAPK10基因沉默轉(zhuǎn)化子的篩選與驗(yàn)證
        3.3.6 PlMAPK10基因的沉默是特異的
        3.3.7 PlMAPK10基因沉默轉(zhuǎn)化子的表型分析
            3.3.7.1 PlMAPK10基因的沉默不影響卵孢子的形成
            3.3.7.2 PlMAPK10基因的沉默影響菌絲生長(zhǎng)速率
            3.3.7.3 PlMAPK10基因的沉默減少游動(dòng)孢子囊的產(chǎn)量而不影響其釋放游動(dòng)孢子
            3.3.7.4 PlMAPK10基因的沉默不影響游動(dòng)孢子的休止與休止孢的萌發(fā)
            3.3.7.5 PlMAPK10基因的沉默導(dǎo)致荔枝霜疫霉的致病性下降
            3.3.7.6 PlMAPK10基因的表達(dá)不受氧化壓力的調(diào)控
            3.3.7.7 PlMAPK10基因的沉默影響荔枝霜疫霉漆酶活性而不影響胞外氧化酶的活性
            3.3.7.8 PlMAPK10基因沉默轉(zhuǎn)化子胞外氧化酶與漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)
    3.4 小結(jié)
第四章 全文討論與總結(jié)論
    4.1 RNA結(jié)合蛋白編碼基因PlM90在荔枝霜疫霉有性生殖與無(wú)性生殖方面的重要作用
        4.1.1 PlM90基因編碼的Puf RNA結(jié)合蛋白在卵菌中高度保守
        4.1.2 PlM90基因影響荔枝霜疫霉的有性生殖過(guò)程
        4.1.3 PlM90基因影響荔枝霜疫霉的無(wú)性生殖過(guò)程
    4.2 PlMAPK10基因在荔枝霜疫霉致病性與漆酶活性方面的重要作用
        4.2.1 荔枝霜疫霉MAPK10基因在卵菌中高度保守
        4.2.2 PlMAPK10基因在荔枝霜疫霉有性生殖與無(wú)性發(fā)育階段的作用
        4.2.3 PlMAPK10基因的沉默減弱了荔枝霜疫霉的致病性
        4.2.4 PlMAPK10基因在調(diào)控荔枝霜疫霉應(yīng)對(duì)植物防衛(wèi)反應(yīng)方面的作用
    4.3 dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默策略與PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)在卵菌中的應(yīng)用與展望
    4.4 總結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄A 酪氨酸代謝通路
    附錄B 氰基氨基酸代謝通路
    附錄C 氨基糖與核苷酸糖代謝通路
    附錄D 花生四烯酸代謝通路
    附錄E 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文、專(zhuān)利與會(huì)議摘要


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]中國(guó)荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀、趨勢(shì)與建議[J]. 齊文娥,陳厚彬,李偉文,張浩軍.  廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2016(06)
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