發(fā)布時(shí)間：2022-02-22 18:32

　　由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的歐美楊細(xì)菌性潰瘍病在國(guó)內(nèi)歐美楊主要種植區(qū)河南、山東大面積發(fā)生,該病害在天津也有分布,是國(guó)內(nèi)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的楊樹細(xì)菌性病害且有發(fā)病面積逐年擴(kuò)大,危害程度加深的趨勢(shì)。然而,對(duì)該病原菌的致病機(jī)理及成災(zāi)機(jī)制研究較少。在細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答以及寄主-病原互作過(guò)程中,雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是最重要的分子調(diào)控機(jī)制之一,被譽(yù)為細(xì)菌的“智商”。為了研究L.quercina subsp.populi雙組分信號(hào)系統(tǒng)對(duì)致病性的調(diào)控機(jī)制,并了解病原菌與寄主互作的關(guān)系,本論文通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定和序列比對(duì)L.quercina subsp.populi N-5-1基因組中的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng);其次,通過(guò)系統(tǒng)地構(gòu)建插入失活突變體與篩選分析致病性表型,選擇其中對(duì)病原菌的生長(zhǎng)速度、游動(dòng)性和毒性有明顯影響的基因,構(gòu)建缺失突變體和互補(bǔ)菌株;然后,尋找靶標(biāo)RR調(diào)控的下游基因,并對(duì)篩選的下游調(diào)控基因進(jìn)行上位分析,解析其調(diào)控致病性的分子機(jī)制。研究結(jié)果如下:（1）利用已測(cè)定的病原細(xì)菌菌株N-5-1的基因組序列,通過(guò)生物信息學(xué)分析,以及識(shí)別與HK和RR磷酸... 

【文章來(lái)源】：北京林業(yè)大學(xué)北京市211工程院校教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 歐美楊細(xì)菌性潰瘍病病菌
        1.1.1 歐美楊細(xì)菌性潰瘍病病原菌基本特性和病害癥狀
        1.1.2 歐美楊細(xì)菌性潰瘍病發(fā)病規(guī)律及防治
        1.1.3 歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌致病基因研究進(jìn)展
    1.2 雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)
        1.2.1 組氨酸激酶的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.2 反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.3 雜合組氨酸激酶的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.4 細(xì)菌中TCSTS的研究進(jìn)展
    1.3 研究的目的及意義
2 Lonsdelea N-5-1 HK和RR插入失活突變體庫(kù)的構(gòu)建
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌種及質(zhì)粒
        2.1.2 生化試劑
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 細(xì)菌遺傳學(xué)基本操作
        2.1.5 總DNA的提取
        2.1.6 大腸桿菌電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.1.7 大腸桿菌的電擊轉(zhuǎn)化
        2.1.8 兩親接合方法
        2.1.9 插入失活突變體的構(gòu)建
        2.1.10 細(xì)菌游動(dòng)性檢測(cè)
        2.1.11 生物檢測(cè)細(xì)菌致病性
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 Lonsdelea N-5-1基因組編碼42個(gè)HK和RR蛋白
        2.2.2 插入失活載體的構(gòu)建
        2.2.3 插入失活突變體庫(kù)的構(gòu)建
        2.2.4 插入失活突變體庫(kù)的表型檢測(cè)
    2.3 小結(jié)與討論
3 kdpD-kdpE的遺傳學(xué)分析及KdpD-KdpE構(gòu)成TCSTS
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌種及質(zhì)粒
        3.1.2 生化試劑
        3.1.3 培養(yǎng)基
        3.1.4 細(xì)菌細(xì)胞總RNA的提取
        3.1.5 消化RNA中的DNA
        3.1.6 反轉(zhuǎn)錄
        3.1.7 讀碼框內(nèi)刪除(缺失)突變體的構(gòu)建
        3.1.8 互補(bǔ)菌株(過(guò)表達(dá)菌株)的構(gòu)建
        3.1.9 互補(bǔ)菌株(過(guò)表達(dá)菌株)的電擊轉(zhuǎn)化
        3.1.10 突變體菌株電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.1.11 耐金屬離子脅迫、鹽脅迫和滲透脅迫檢測(cè)
        3.1.12 透射電鏡觀察細(xì)菌鞭毛
        3.1.13 抑菌活性檢測(cè)
        3.1.14 蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.15 點(diǎn)突變蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.16 可溶性蛋白(His6標(biāo)簽)的表達(dá)和純化
        3.1.17 可溶性蛋白(MBP標(biāo)簽)的表達(dá)和純化
        3.1.18 提取膜蛋白(inverted membrane vesicles,IMV)
        3.1.19 Western blot
        3.1.20 蛋白的磷酸化檢測(cè)
        3.1.21 微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)(MST)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 Lqp0375-Lqp0376操縱子結(jié)構(gòu)解析
        3.2.2 Lqp0375-Lqp0376蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)
        3.2.3 kdpD-kdpE讀碼框內(nèi)刪除突變體和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        3.2.4 kdpD-kdpE缺失對(duì)毒性的影響
        3.2.5 kdpD-kdpE缺失對(duì)游動(dòng)性的影響
        3.2.6 kdpD-kdpE缺失對(duì)氧化脅迫和抗性脅迫的影響
        3.2.7 KdpD和KdpE蛋白及其點(diǎn)突變KdpD~(H682A)和KpE~(D53A)蛋白的表達(dá)純化
        3.2.8 KdpD是一個(gè)具有激酶活性的組氨酸激酶
        3.2.9 KdpD特異性結(jié)合KdpE
    3.3 小結(jié)與討論
4 KdpE調(diào)控機(jī)理解析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌種及質(zhì)粒
        4.1.2 生化試劑
        4.1.3 培養(yǎng)基
        4.1.4 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)
        4.1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        4.1.6 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 KdpE調(diào)節(jié)子的ChIP-seq分析
        4.2.2 EMSA分析表明KdpE直接結(jié)合3個(gè)靶基因的啟動(dòng)子區(qū)
        4.2.3 KdpE正調(diào)控3個(gè)靶基因的表達(dá)
        4.2.4 遺傳上位分析kdpE與3個(gè)靶基因的關(guān)系
    4.3 小結(jié)與討論
5 結(jié)論與討論
參考文獻(xiàn)
附表
個(gè)人簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介(一)
導(dǎo)師簡(jiǎn)介(二)
導(dǎo)師簡(jiǎn)介(三)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌hrcJ基因的功能分析[J]. 李賓,李愛(ài)寧,魏強(qiáng),王海明,賀偉.  林業(yè)科學(xué). 2015(12)
[2]歐美楊潰瘍病防治的初步研究[J]. 徐方媛,賀偉,常聚普,郭利民,謝守江,楊玉巧.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2013(16)
[3]歐美楊潰瘍病的病原鑒定[J]. 賀偉,任飛娟,郭利民,李永,常聚普.  林業(yè)科學(xué). 2009(06)
[4]濮陽(yáng)市發(fā)現(xiàn)楊樹新病害[J]. 郭利民,張鳴放,王洪軒.  河南林業(yè)科技. 2008(03)

博士論文
[1]歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌侵染循環(huán)及病害流行研究[D]. 商靖.北京林業(yè)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]歐美楊細(xì)菌性潰瘍病發(fā)生影響因素分析[D]. 倪琳.北京林業(yè)大學(xué) 2014
[2]歐美楊潰瘍病病原鑒定[D]. 任飛娟.北京林業(yè)大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3640002