大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的嚴(yán)重危害大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一。近年來,大豆疫霉根腐病在我國大豆主產(chǎn)區(qū)呈逐漸擴(kuò)大蔓延的趨勢,并造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。合理利用抗、耐病品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑,然而大豆疫霉生理小種進(jìn)化速度快、毒力結(jié)構(gòu)趨于復(fù)雜化,常規(guī)育種工作周期長,抗性資源有限,很難滿足生產(chǎn)的需要。因此,研究大豆與疫霉互作的分子機(jī)理則是解釋病害發(fā)生機(jī)制,解決該問題的根本途徑之一。植物在發(fā)育過程中為了抵御病原物的侵染,逐漸形成并完善了一系列復(fù)雜有效的保護(hù)機(jī)制和防御網(wǎng)絡(luò)。植物miRNA通過指導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用。gma-miRl510是本實驗室前期利用生物芯片技術(shù)鑒定的一個參與大豆響應(yīng)疫霉菌侵染的miRNA,其預(yù)測靶基因能夠編碼NB-LRR型抗病蛋白,本研究通過5’-RACE方法鑒定其靶標(biāo)基因,并將gma-miR1510在大豆發(fā)狀根組織中過表達(dá),研究其在大豆一大豆疫霉互作過程中的功能。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族之一,是調(diào)節(jié)植物生理過程信號網(wǎng)絡(luò)的重要組成成分,本研究通過RNA干擾的方法,將GmWRKY40基因進(jìn)行沉默,研究其在大豆響應(yīng)疫... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２－１?ｇｍａ－ｍｉＲｌ?５１０在大豆中的表達(dá)模式??Ｆｉｇ．?２－１?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｒｏｆｉｌｅｓ?ｏｆ?ｇｍａ－ｍｉＲ１５１０?ｉｎ?ｓｏｙｂｅａｎ．??

離得到ｍＲＮＡ，然后在ｍＲＮＡ的５’端連接ＲＮＡ接頭，將其反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ，最后利??用Ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?５’－ＲＡＣＥ?ｐｒｉｍｅｒ擴(kuò)增預(yù)測長度的革Ｅ基因，得到與預(yù)測大小一致的陽性??克隆對其進(jìn)行測序分析。如圖２－２所示，結(jié)果顯示基因的斷裂位點??與預(yù)測的一致，該基因編碼典型的ＴＩＲ和ＮＢ－ＬＲＲ植物抗病結(jié)構(gòu)域，說明ｇｍａ－ｍｉＲｌ?５丨０??很可能通過直接調(diào)控ＮＢ結(jié)構(gòu)域抗病基因來參與大豆對疫霉的抗性。??ｒ?＿＿＿?

通過酶切、連接的方法插入到植物雙元表達(dá)載體ＰＣＡＭＢＩＡ２３０１中，構(gòu)建了?ｍｉＲ１５１０ａ／ｂ??過表達(dá)載體。通過發(fā)根農(nóng)桿菌Ｋ５９９介導(dǎo)的大豆子葉遺傳轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)化大豆，誘導(dǎo)產(chǎn)??生發(fā)狀根（圖２－５，Ａ）。首先，利用ｐＣＡＭＢ丨Ａ２３０１載體上的ＧＵＳ報告基因，通過??ＧＵＳ組織化學(xué)染色的方法對發(fā)狀根進(jìn)行初步篩選，轉(zhuǎn)基因的陽性根可以顯藍(lán)色（圖??２－５，?Ｂ）；其次，在ａｔｈ－ｍｉＲ３１９ａ的前體骨架序列中以及ＧＵＳ基因序列中分別設(shè)計一－??對引物，利用半定量ＲＴ－ＰＣＲ在ＤＮＡ水平進(jìn)行分子驗證（圖２－５，?Ｃ）；最后利用ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ??ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測ｍｉＲＩ５ＩＯａ／ｂ成熟體的表達(dá)豐度，如圖２－５，?Ｄ所示，與轉(zhuǎn)空載體的對照??相比，轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中ｍｉＲＩ５ｌ（）ａ和ｍｉＲ１５１０ｔ）的表達(dá)量分別是對照的５倍和２倍，??說明擬南芥ｍｉＲ３ｌ９ａ的前體骨架可以成功地用于過表達(dá)ｍｉＲＩ５１０，我們獲得的轉(zhuǎn)基因??發(fā)狀根用于進(jìn)一步的功能研宄。我們進(jìn)一步分析靶基因扣在過表達(dá)??ｍｉＲＩ５ＩＯａ／ｂ的發(fā)狀根中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ｍｉＲ１５１０ａ／ｂ的過表達(dá)明顯抑制??㈨的轉(zhuǎn)錄水平（圖２－５


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