家蠶（Bombyx mori）既是一種重要的經(jīng)濟昆蟲,也是鱗翅目昆蟲的模式生物,在昆蟲的生理、病理遺傳和免疫等領(lǐng)域具有重要作用。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是對家蠶危害最嚴(yán)重的病原真菌,被感染的家蠶無法結(jié)繭或化蛹,從而對蠶業(yè)生產(chǎn)與經(jīng)濟造成重大損失。本實驗從前期構(gòu)建的家蠶感染白僵菌的數(shù)字基因表達譜中,篩選出差異表達的家蠶性別特異性貯存蛋白基因BmSP2（Bombyx mori sex-specific storage-protein 2,BmSP2）,克隆、表達并研究其對白僵菌的免疫功能。得到的實驗結(jié)果如下:1.克隆BmSP2的開放閱讀框（Open Reading Frame,ORF）并利用原核系統(tǒng)表達BmSP2蛋白,驗證BmSP2蛋白對白僵菌的抑制作用。以BmSP2為研究對象,以家蠶p50品種為實驗材料,通過RT-PCR方法克隆、獲得該基因的開放閱讀框序列,該序列有2112個堿基,編碼703個氨基酸,其中第1-18個氨基酸為信號肽。將BmSP2目的片段連接到pET-28a表達載體上構(gòu)建pET-28a-BmSP2載體,在16℃以0.8mM的IPTG成功誘導(dǎo)表達可溶性... 

【文章來源】：江蘇科技大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
英文縮寫說明
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 白僵菌對家蠶的危害
    1.2 昆蟲貯存蛋白的研究
        1.2.1 貯存蛋白的介紹
        1.2.2 昆蟲的免疫應(yīng)答
        1.2.3 貯存蛋白的免疫作用
    1.3 轉(zhuǎn)座子的發(fā)展與應(yīng)用
        1.3.1 轉(zhuǎn)座子的簡單介紹
        1.3.2 PiggyBac轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用和發(fā)展
    1.4 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.4.1 研究內(nèi)容
        1.4.2 技術(shù)路線
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 家蠶貯存蛋白BmSP2的克隆、表達及時空特異性表達
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 材料
        2.1.2 實驗儀器與設(shè)備
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 常用溶液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 準(zhǔn)備家蠶材料
        2.2.2 提取總RNA
        2.2.3 反轉(zhuǎn)錄成cDNA
        2.2.4 BmSP2的序列分析
        2.2.5 BmSP2的克隆
        2.2.6 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒并測序
        2.2.7 構(gòu)建BmSP2的重組表達質(zhì)粒pET-28a-BmSP
        2.2.8 表達目的蛋白
        2.2.9 檢測并純化目的蛋白
        2.2.10 測定目的蛋白的濃度
        2.2.11 實時熒光定量PCR
    2.3 實驗結(jié)果與分析
        2.3.1 BmSP2的克隆
        2.3.2 BmSP2的蛋白表達分析
        2.3.3 BmSP2基因的時空特異性表達分析
    2.4 討論
第三章 家蠶貯存蛋白BmSP2對白僵菌的抑制作用
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 家蠶的飼養(yǎng)與球孢白僵菌的復(fù)壯
        3.1.2 主要實驗儀器
        3.1.3 主要試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 制備白僵菌孢子懸液
        3.2.2 家蠶感染球孢白僵菌
        3.2.3 提取RNA
        3.2.4 反轉(zhuǎn)錄成cDNA
        3.2.5 實時熒光定量PCR
        3.2.6 檢測目的蛋白對白僵菌的抑制作用
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 球孢白僵菌感染家蠶的結(jié)果
        3.3.2 BmSP2在感染白僵菌的家蠶中的表達特征分析
        3.3.3 BmSP2對白僵菌的抑制作用分析
    3.4 討論
第四章 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠶驗證BmSP2對白僵菌的抑制作用
    4.1 材料與試劑
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 主要實驗儀器
        4.1.3 主要試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 制備白僵菌孢子懸液
        4.2.2 設(shè)計過表達載體
        4.2.3 擴增過表達載體中的片段
        4.2.4 構(gòu)建含有BmSP2片段的過表達載體
        4.2.5 質(zhì)粒抽提與純化
        4.2.6 家蠶卵的顯微注射
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 構(gòu)建完成的過表達質(zhì)粒及圖譜
        4.3.2 轉(zhuǎn)基因BmSP2過表達個體與白僵菌的互作試驗
    4.4 討論
結(jié)論
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]家蠶儲存蛋白Storage protein（SP3）基因克隆及調(diào)節(jié)黑化作用的研究[D]. 何漸鳴.蘇州大學(xué) 2014



本文編號：3592290