谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶（Glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT）是己糖胺生物合成途徑的限速酶,主要位于胞質(zhì)內(nèi),在不同物種間較為保守。己糖胺合成途徑作為能量的感受器,可以整合葡萄糖、氨基酸、脂質(zhì)和核苷酸代謝等代謝途徑。己糖胺合成途徑的終產(chǎn)物UDP-GlcNAc參與了糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等物質(zhì)的合成,在細(xì)胞中的生物學(xué)意義非常重要。在昆蟲中,己糖胺合成途徑又是幾丁質(zhì)代謝的組成部分。柞蠶作為我國特有的一種重要絹絲類昆蟲,它的生長發(fā)育離不開能量代謝和骨骼重塑。柞蠶體壁的外表層和內(nèi)表層由幾丁質(zhì)與蛋白質(zhì)組成,柞蠶干蛹中的幾丁質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占2.8%。但是該合成途徑還未在柞蠶中發(fā)現(xiàn),GFAT作為該途徑的重要節(jié)點,對其研究發(fā)現(xiàn)有重要意義。磷酸化是調(diào)節(jié)GFAT活性的重要方式,在人源、小鼠,果蠅等不同物種中均有GFAT磷酸化報道。該蛋白由于活性不穩(wěn)定,其在真核表達(dá)體系中大量表達(dá)、純化一直成為難點。本研究旨在利用柞蠶核型多角體病毒表達(dá)體系,表達(dá)、純化出具有活性的柞蠶谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶（ApGFAT）。首先從柞蠶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)... 

【文章來源】：大連理工大學(xué)遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

己糖胺生物合成途徑Fig.1.3HexosamineBiosyntheticPathway

柞蠶核型多角體病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ApGFAT的研究-4-首先兩個結(jié)構(gòu)域活性口袋開放，Q-環(huán)被Arg539*（在不同物種GFAT保守）錨定，Trp74阻斷氨通道。(2)Fru-6-P進(jìn)入糖異構(gòu)酶活性口袋，C-tail關(guān)閉(3)Fru-6-P的糖環(huán)打開后，與Lys603形成席夫堿(Schiffbase)。(4)谷氨酰胺進(jìn)入谷氨酰胺酶后脫氨，氨通道打開，氨進(jìn)入糖異構(gòu)酶。(5)氨與開環(huán)后的Fru-6-P反應(yīng)生成GlcNAc-6-P，水分子通過通道進(jìn)入谷氨酰胺酶，生成谷氨酸鹽釋放出去。圖1.4GlmS催化過程Fig.1.4ThecatalyticcycleofGlmS真核生物與原核物之間的糖異構(gòu)酶和谷氨酰胺酶結(jié)構(gòu)域活性位點都完全保守，但結(jié)構(gòu)域間連接子在原核生物內(nèi)顯示出高度的異質(zhì)性，而真核域間連接子有很好地保守性。2009年[16]，首次獲得了人源GFAT1的糖異構(gòu)酶二聚體晶體結(jié)構(gòu)，且人類GFAT1的活性位點與GlmS相似，表明GFAT1的二聚體結(jié)構(gòu)狀態(tài)是生物學(xué)相關(guān)狀態(tài)。GFAT1的糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域由兩個拓?fù)湎嗨频膩喗Y(jié)構(gòu)域控制，每個亞結(jié)構(gòu)域都包括一個由α螺旋圍繞的五層平行的β折疊片，構(gòu)成了α/β/α折疊特征（圖1.5）。UDP-GlcNAc結(jié)合通過與Gly355，Thr447，Thr458，Gly461的氫鍵以及焦磷酸鹽與Arg343和His463之間的離子相互作用而穩(wěn)定[17]。

大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文-5-圖1.5hGFAT晶體結(jié)構(gòu)Fig.1.5hGFATcrystalstructure關(guān)于GFAT的研究在近年來越發(fā)起人們重視，其表達(dá)調(diào)控受到嚴(yán)格的控制，它的異常將導(dǎo)致胰島素抵抗[18]、糖尿病血管并發(fā)癥等相關(guān)代謝紊亂疾病以及阿茲海默癥和癌癥等疾玻GFAT的研究大多數(shù)集中在與糖尿病和并發(fā)癥的關(guān)系上。亞裔印度人是Ⅱ型糖尿病的高危人群，研究表明在淋巴細(xì)胞中GFAT活性與GFATmRNA水平、糖化血紅蛋白水平、胰島素抵抗、餐后血糖水平和血漿氧化損傷標(biāo)志物水平呈正相關(guān)。動脈粥樣硬化是糖尿病的常見并發(fā)癥。血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）是一種抗血管生成和促動脈粥樣硬化蛋白，其轉(zhuǎn)錄被HBP激活。GFAT的過表達(dá)增加了人主動脈平滑肌細(xì)胞TSP-1的mRNA水平[19]。HepG2中GFAT的過量表達(dá)增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)和炎性途徑激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與糖尿病的動脈粥樣硬化的發(fā)展。近年來，GFAT與癌癥的關(guān)系引起了人們的重視，異常的葡萄糖代謝是癌細(xì)胞的特征之一。胰腺導(dǎo)管腺癌（PDA）普遍由Kras癌基因的突變引發(fā)，突變體Kras通過上調(diào)GFAT來驅(qū)動葡萄糖通入己糖胺生物合成途徑，促進(jìn)代謝途徑來支持癌細(xì)胞中的新陳代謝，從而在嚴(yán)峻的腫瘤微環(huán)境中支持生存和增殖。GFAT1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期和總生存期（OS）呈正相關(guān)。研究表明，GFAT1可作為OS的獨立預(yù)測因子，它的表達(dá)水平可預(yù)測胰腺癌患者的預(yù)后不良[20]。磷酸化是調(diào)節(jié)GFAT活性的重要方式。早期GFAT被認(rèn)為受蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA）調(diào)控，2007年YanyanLi等[21]通過體外AMP激活的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）磷酸化修飾的方式鑒定出人源GFAT1蛋白的S243位點。如圖所示，5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷（AICAR）或血管內(nèi)皮生長因子

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號：3586394