番木瓜（Carica papaya L.）是一種廣受人們喜愛的水果和重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物,但番木瓜果樹自身抗病毒力較弱,很容易受到病毒的侵害,其中番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）是一種新的威脅番木瓜種植業(yè)的病毒病害,近年來發(fā)病率逐年遞增,已成為繼木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）為害最嚴(yán)重的病毒病害。目前,PLDMV在栽培技術(shù)上如PRSV一樣也很難通過化學(xué)防治的方法予以防控。所以,急需尋找到一種更為安全且廣譜的抗病毒新策略。而這種抗病毒新策略的獲得需要在PLDMV致病機(jī)理、PLDMV弱毒株“植物疫苗”及基因功能鑒定等方面取得一定的工作積累。本研究就是基于這些關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)開展了系列的研究,以期為開辟安全廣譜的抗PLDMV新策略奠定良好的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。開展上述這些研究工作,都會(huì)涉及植物病毒表達(dá)載體構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié),這是研究植物病毒的基礎(chǔ),也是最為關(guān)鍵的內(nèi)容之一。由于許多植物病毒基因組較大,且會(huì)在大腸桿菌體內(nèi)產(chǎn)生毒性,所以帶有病毒全長表達(dá)載體的構(gòu)建一直是研究工作的難點(diǎn)。本研究通過將病毒全長... 

【文章來源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

PLDMV基因組序列

海南大學(xué)博士學(xué)位論文8中（GomordV，et.al，1984）。接下來，外國學(xué)者Ahlquist在80年代應(yīng)用BMV-Russian株系研制了兩種載體，將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因進(jìn)行表達(dá)（Alquist，P，et.al，1986）。現(xiàn)如今，RNA病毒受到廣泛關(guān)注并取得了很多研究成果，RNA和DNA病毒都能夠以表達(dá)載體的形式進(jìn)行更深入的分析（Boyer，RL，et.al，2004）。（1）利用植物病毒表達(dá)外源基因的研究進(jìn)展在研究植物病毒與寄主的互作方面，植物病毒表達(dá)載體最廣泛地應(yīng)用是在植物病毒中插入GFP或者其他熒光報(bào)告基因，在插入報(bào)告基因的植物病毒侵染植株后出現(xiàn)癥狀時(shí)，染病的植株在特定紫外燈光照射下，可以顯著的觀察到病毒在植物中的累積部位所發(fā)出的熒光，可用于研究病毒在寄主中的復(fù)制，積累與運(yùn)動(dòng)示蹤（如圖2）。圖2UV燈照射下PLDM模式PLDMVV-GFP感病植株與健株對照Fig.2PLMV-GFPplantsandhealthyplantsunderUVLAMP而在病毒基因片段中插入抗體標(biāo)簽則還可以進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。在FeRNAndoMartínez的研究中，將煙草蝕紋病毒中的P1蛋白插入Strep標(biāo)簽并侵染植物，利用免疫共沉淀的IP產(chǎn)物進(jìn)行分析，以研究病毒基因功能（FeRNAndoMartínez，et.al，2014）。因?yàn)橹参锊《静荒軌蚯秩镜絼?dòng)物細(xì)胞，同時(shí)植物病毒在蛋白以及表達(dá)外源肽領(lǐng)域擁有良好的自身特性，所以植物成為相對于普通細(xì)胞培育成本更低以及可靠性更強(qiáng)的培育系統(tǒng)。此外，植物生物反應(yīng)器作為病毒的媒介時(shí)擁有很多優(yōu)勢例如：種類豐富，操作簡單以及培育風(fēng)險(xiǎn)低等，使得該技術(shù)有希望成為現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)的替代方法（李巧麗，2004）。在病毒表達(dá)系統(tǒng)中，新型疫苗的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，眾多學(xué)者都在努力的將不同作物病毒媒介研制成不同類型的外源蛋白表達(dá)載體（表2），蛋白多

番木瓜畸形花葉病毒在寄主基因功能鑒定及交叉保護(hù)中的應(yīng)用17圖3病毒來源小RNA形成機(jī)制（錢李超等，2014）Fig.3TheformationmechanismofVsiRNA（QIANLiChao，et.al，2014）VIGS分子作用機(jī)制隨著研究的深入被逐步的明確闡述：當(dāng)前研究表明VIGS的作用機(jī)制存在起始階段、維持階段以及信號(hào)擴(kuò)增階段。雙鏈RNA（dsRNA）是誘發(fā)基因沉默的主要原因，帶有目的基因片段的載體到達(dá)細(xì)胞后直接轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA，再以生成的單鏈RNA為模版基于RNA聚合酶（RdPR）的作用形成雙鏈RNA（dsRNA），在DICER酶特異性識(shí)別作用下將dsRNA分割為21-23bp的短鏈核苷酸，并被細(xì)胞內(nèi)的解旋酶分解為單鏈RNA（siRNA），siRNA作為導(dǎo)向RNA會(huì)在RdRp的作用下與細(xì)胞內(nèi)的ssRNA配對合成dsRNA，產(chǎn)生全新的dsRNA再一次被DICER酶進(jìn)一步切割，以此不間斷的重復(fù)可以放大信號(hào)，最后目的基因的mRNA被降解（圖3），使目的基因沉默（Purkayastha&Dasgupta，2009）。（3）VIGS病毒載體的研究進(jìn)展現(xiàn)階段VIGS載體的實(shí)驗(yàn)方法主要是將不同的作物病毒當(dāng)成VIGS的基礎(chǔ)載體以研究作物基因功能。目前研究成果中主要存在三類病毒載體，分別是DNA病毒、RNA病毒以及衛(wèi)星病毒加工產(chǎn)生的載體，這三類病毒載體自身的特點(diǎn)決定了他們的適用領(lǐng)域。1)由RNA病毒構(gòu)建的VIGS載體學(xué)者Kumagai等最先通過煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）載體對煙草胡蘿卜素生成渠道中的一個(gè)重要酶PDS進(jìn)行了沉默，因?yàn)轭惡}卜素在植物體內(nèi)擁有光保護(hù)功能，所以侵染作物的葉片變成白色（Kumagai，et.al，1995）。接著

【參考文獻(xiàn)】：
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