真菌細(xì)胞壁涉及細(xì)胞附著,形態(tài)建成等多種生理功能。細(xì)胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病過程中發(fā)揮著非常重要的作用。熒光增白劑高度敏感蛋白cwh具有維持細(xì)胞壁完整性的功能,這一現(xiàn)象僅在釀酒酵母中有報(bào)道,在致病真菌中尚無該類基因的研究和報(bào)道。昆蟲病原真菌具有獨(dú)特的體壁侵染方式,細(xì)胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病過程中發(fā)揮著十分重要的作用。本研究以蝗綠僵菌（Metarhizium acridum）為實(shí)驗(yàn)材料,通過同源重組的方法構(gòu)建該基因的敲除及回復(fù)菌株對(duì)該基因進(jìn)行功能研究。獲得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.Macwh1和Macwh2生物信息學(xué)分析根據(jù)蝗綠僵菌基因組序列設(shè)計(jì)引物,克隆得到Macwh1和Macwh2基因,生物信息學(xué)分析表明Macwh1與Macwh2編碼的氨基酸序列無同源性。其中Macwh1登錄號(hào)為XP₀07815818,編碼957個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為7.02,蛋白質(zhì)分子量為107.02KDa,基因組含7個(gè)內(nèi)含子。Macwh2登錄號(hào)為XP₀07808921,編碼的氨基酸133個(gè),等電點(diǎn)為9.48,蛋白質(zhì)分子量為13.85KDa,基因組含2個(gè)內(nèi)含子。2.M... 

【文章來源】：重慶大學(xué)重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Macwh1、Macwh2的生物信息學(xué)分析

28LCWH1F/PtR2與RCWH1R/BaF2為引物，PCR擴(kuò)增后分別得到約1200bp、1100bp的條帶（圖2.2 b），證明Macwh1左右臂成功連接在Bar基因的兩側(cè)。在構(gòu)建回復(fù)載體時(shí)，先對(duì)Macwh1全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆，再連接于帶有Sur篩選標(biāo)記的載體中完成回復(fù)載體的構(gòu)建（圖2.2 a）。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蝗綠僵菌，獲得Macwh1的敲出轉(zhuǎn)化子，利用選擇培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選，然后進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證。在野生型中檢測(cè)得到一條約4000 bp的條帶，在敲除突變體中，由于Bar基因成功替代了含有BglII酶切位點(diǎn)的那段序列，得到約2600 bp的條帶

同理，以同源重組的原理在抗性篩選標(biāo)記基因Sur基因的上下游分別連接上Macwh2基因的左右臂，完成敲除載體的構(gòu)建（圖2.3 a）。分別以LCWH2F/Sur-R與RCWH2R/Sur-F為引物， PCR驗(yàn)證后電泳檢測(cè)得到約1100bp、1200bp的條帶（圖2.3 b），證明Macwh1左右臂成功連接在Sur基因的兩側(cè)。在構(gòu)建回復(fù)載體中，先對(duì)Macwh2全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆，再連接于帶有Bar基因篩選標(biāo)記的載體中完成回復(fù)載體的構(gòu)建（圖2.3 a）。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蝗綠僵菌，再利用選擇培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選，然后進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證，在野生型中檢測(cè)得到一條約2000 bp的條帶


本文編號(hào)：3582039