微孢子蟲（Microsporidia）是一類屬于微孢子蟲目的真核微生物,能引發(fā)宿主的腦炎、腸炎及腎炎等疾病,宿主范圍廣泛。先前的研究已證明狐貍感染的微孢子蟲是兔腦炎微孢子蟲,感染的幼狐在分窩前后發(fā)病,食欲不濟(jì)、嗜睡、毛皮粗糙,嚴(yán)重的還會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及肉芽腫性腦炎,給狐貍養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。我們的研究表明可利用基因重組技術(shù)表達(dá)微孢子蟲孢壁蛋白SWP1建立ELISA診斷方法。但它常依賴實(shí)驗(yàn)室專有的儀器、設(shè)備與人員。因此建立一種便宜、快速、準(zhǔn)確的診斷方法意義重大。本研究以提純的狐貍IgG為抗原,免疫BALB/c小鼠,利用細(xì)胞融合技術(shù),制備雜交瘤,采用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆,得到3株能穩(wěn)定分泌針對(duì)狐貍IgG的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為E2、1E3、2G10。Western Blot結(jié)果顯示,這3株單抗能和狐貍IgG特異性結(jié)合。抗體亞型鑒定表明,E2、1E3和2G10的重鏈均為IgG1,輕鏈均為Kappa鏈。生產(chǎn)提純的1E3雜交瘤腹水單抗經(jīng)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)效價(jià)可達(dá)6000。將微孢子蟲孢壁蛋白SWP1基因片段克隆到含GST標(biāo)簽的PcoldⅢ載體中,利用原核表達(dá)系... 

【文章來(lái)源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 微孢子蟲概述
        1.1.1 微孢子蟲的分類地位
        1.1.2 微孢子蟲的生活史
        1.1.3 微孢子蟲孢子形態(tài)
        1.1.4 微孢子蟲的感染機(jī)制
        1.1.5 微孢子蟲蛋白的研究
        1.1.6 微孢子蟲傳播方式及兔腦炎微孢子蟲重要宿主感染情況
        1.1.7 兔腦炎微孢子蟲的分子流行病學(xué)
        1.1.8 微孢子蟲診斷技術(shù)
    1.2 單克隆抗體技術(shù)
        1.2.1 雜交瘤技術(shù)原理
        1.2.2 單克隆抗體應(yīng)用
    1.3 膠體金免疫層析技術(shù)
        1.3.1 膠體金
        1.3.2 膠體金免疫試紙條
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 血清、細(xì)胞與菌種
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 主要試劑與溶液
        2.1.4 主要儀器與耗材
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 狐貍IgG的制備與純化
        2.2.2 抗原乳化
        2.2.3 動(dòng)物免疫
        2.2.4 細(xì)胞融合
        2.2.5 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆化
        2.2.6 單克隆抗體細(xì)胞株上清液Western Blot分析
        2.2.7 單克隆抗體細(xì)胞株的凍存與復(fù)蘇
        2.2.8 單克隆抗體的大量生產(chǎn)及純化
        2.2.9 單克隆抗體亞類的鑒定
        2.2.10 Western Blot鑒定腹水提純單抗特異性
        2.2.11 SWP1蛋白的表達(dá)與純化及ELISA檢測(cè)
        2.2.12 兔抗狐貍IgG多抗的制備
        2.2.13 膠體金的制備
        2.2.14 膠體金抗體最小標(biāo)記量的確定
        2.2.15 膠體金標(biāo)記單抗 1E3的制備
        2.2.16 試紙條的組裝及結(jié)果判定
        2.2.17 特異性試驗(yàn)
        2.2.18 重復(fù)性試驗(yàn)
        2.2.19 靈敏性試驗(yàn)
        2.2.20 穩(wěn)定性試驗(yàn)
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 狐貍IgG的提純
    3.2 細(xì)胞融合
    3.3 抗原的最佳包被濃度的確定
    3.4 單克隆抗體細(xì)胞株上清Western Blot結(jié)果
    3.5 單克隆抗體亞型鑒定
    3.6 腹水單抗的純化
    3.7 SWP1蛋白的濃度與ELISA檢測(cè)結(jié)果
    3.8 兔子多抗瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)
    3.9 膠體金標(biāo)記的最佳蛋白量
    3.10 檢測(cè)線SWP1蛋白及質(zhì)控線兔抗狐IgG多抗的濃度確定
    3.11 試紙條結(jié)果判定
    3.12 特異性試驗(yàn)
    3.13 重復(fù)性試驗(yàn)
    3.14 靈敏性試驗(yàn)
    3.15 穩(wěn)定性試驗(yàn)
4 討論
    4.1 動(dòng)物免疫
    4.2 細(xì)胞融合
    4.3 制備飼養(yǎng)細(xì)胞
    4.4 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆
    4.5 抗體的大量制備與純化
    4.6 膠體金試紙條的制備
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大片形吸蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條的研制及初步應(yīng)用[J]. 王華俊,劉宇,蔣薇,趙雪麗,曹偉偉,陳漢忠,閆若潛.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2017(01)
[2]雞毒支原體膠體金免疫層析試紙條的研制和初步應(yīng)用[J]. 寧官保,劉國(guó)莉,張鼎,李宏全,馬海利,高榮琨,郝衛(wèi)芳,高文偉,趙宇軍,高詩(shī)敏,李建慧,李桂蘭,閆芳,田文霞.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2015(05)
[3]黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)技術(shù)研究[J]. 謝琿,章先,王歆,凡鵬程,時(shí)玉菲,方維煥.  微生物學(xué)通報(bào). 2015(10)
[4]布魯氏菌抗體膠體金免疫層析法快速檢測(cè)技術(shù)的建立[J]. 程婷婷,石峰,陳創(chuàng)夫,王遠(yuǎn)志,張輝,李志強(qiáng),魯芝子,監(jiān)通,馬齊蔓.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2014(02)
[5]A群豬輪狀病毒VP7蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 遲延彬,陳建飛,時(shí)洪艷,張?chǎng)?石達(dá),李長(zhǎng)龍,韓斅,陳洪巖,馮力.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2014(02)
[6]藍(lán)舌病病毒重組VP7蛋白單克隆抗體制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 耿宏偉,秦永麗,李俊平,楊濤,孫恩成,劉霓紅,白安斌,徐青元,王凌鳳,趙晶,覃紹敏,林俊,郭怡璠,吳東來(lái).  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(05)
[7]單克隆抗體制備技術(shù)的最新進(jìn)展及應(yīng)用前景[J]. 孔君,劉箐,韓躍武,王天昌,劉金芝.  免疫學(xué)雜志. 2011(02)
[8]噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 劉相葉,鄧洪寬,吳秀萍,王學(xué)林,于申業(yè),于艷玲,劉明遠(yuǎn).  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2008(01)
[9]豬繁殖與呼吸綜合征膠體金抗體檢測(cè)技術(shù)的建立和初步應(yīng)用[J]. 崔尚金,姜建宏,周艷君,仇華吉,童光志.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2005(03)
[10]人CD137單抗對(duì)急性白血病T淋巴細(xì)胞亞群的影響及意義[J]. 馬肖容,張王剛,曹星梅,陳銀霞,田瑋,楊惠云.  腫瘤防治雜志. 2005(01)



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