三七是中國特有的中藥材,藥用價值高,市場需求量大,但受連作障礙的影響,產(chǎn)業(yè)發(fā)展嚴重受阻。土壤消毒作為一種高效、廣譜的病蟲害防治方法,對土壤中的真菌、細菌、線蟲、害蟲等均有殺滅作用,在遏制番茄、黃瓜、草莓等土傳病害方面效果顯著,但在中藥材上應用較少。本文以腐皮鐮刀菌引起的三七根腐病為研究對象,建立了腐皮鐮刀菌型三七根腐病的實時熒光定量PCR法,探討了三種熏蒸劑對腐皮鐮刀菌的抑制效果和作用機制,并用高通量測序的方法研究了氯化苦在三七種植地應用后對土壤微生物群落結構和多樣性的影響。主要研究結果如下:1.調查了三七種子的帶菌情況,種子表面和內部攜帶的病原菌種類差異較大。三七種子表面攜帶的真菌主要為鐮刀菌,種子內部攜帶的真菌主要為番茄織球殼菌萎蔫病。2.明確了腐皮鐮刀菌是三七根腐病的重要病原物,能導致三七根部腐爛,植株死亡。系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)三七上的腐皮鐮刀菌屬于兩個不同的�；�,其中一個是腐皮鐮刀菌根生專化型。3.基于腐皮鐮刀菌TEF-1α基因設計了一對新的引物,建立了能特異性檢測土壤中腐皮鐮刀菌的qPCR法,該方法重復性良好,靈敏度高,最低可檢測0.5 fgDNA和1個分生孢子/g土壤。4.... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖３－１?ＰＤＡ培養(yǎng)基上腐皮鐮刀菌的菌落形態(tài)?

３．４．２柯赫氏法則驗證結果??接種７天后，所有接種孢子懸浮液的種苗都有了發(fā)病癥狀，接種的部位長出濃密的白色菌絲??體，菌絲體周圍變成黒褐色，剖開種苗內部觀察到內部腐爛成豆腐渣狀，呈黃綠色，詳見圖３－３。??柯赫氏法則驗證結果表明，該菌是三七的致病菌，能導致根腐病的發(fā)病癥狀。??３．４．３分子生物學鑒定結果??以?ＩＴＳ１?和?ＩＴＳ４?為引物，對獲得的菌株（０６０８，?０６０９，０６１０，０６１１，０６１２，０６１８，０６２２）的??進行常規(guī)ＰＣＲ擴增，并對ＰＣＲ產(chǎn)物測序，發(fā)現(xiàn)這７個菌株的ＩＴＳ序列相似度高達９９％，并且與??腐皮鐮刀菌的序列高度一致。進一步對０６１８菌株的ＩＴＳ序列進行了?ＰＣＲ擴增和克隆測序，將測??序結果進行Ｂｌａｓｔ比對，結果發(fā)現(xiàn)該菌株的ＩＴＳ序列與腐皮鐮刀菌根生�；停疲鳎螅幔睿В鳎�?ｆ．?ｓｐ．??ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ?（ＡＢ５１３８５１．１）序列相似度達?１００％。??將上述７個菌株的ＩＴＳ序列與腐皮謙刀菌根生�；汀ⅲ疲鳎螅幔颍�?ＴＯ／ａｒａ＇?ｆ．?ｓｐ．?腐??皮銀刀菌甘薯�；�?Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉｆ?ｓｐ．?ｂａｔａｔａｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉ?ｆ．?ｓｐ．?ｇｆｙｃｉｎｅｓ、Ｆｕｓｃｉｒｉｕｍ?ｓｏｌａｎｉ??ｆ．ｓｐ．ｅｗａｒ／／／的ＩＴＳ序列進行比對，以尖孢鐮刀菌作為外圍菌群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖３－４）。從??系統(tǒng)發(fā)育樹看，獲得的７個菌株劃分到兩類專化型，其中０６１１、０６１２、０６１８、０６２２等４個菌株??劃分到腐皮鐮刀菌根生�；头种е�

＂＂＂＇??圖３－４基于ＩＴＳ序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹??（系統(tǒng)發(fā)育樹基于最大似然法，自展重復率為１０００步）??３．４．４實時熒光定量ＰＣＲ分析結果??３．４．４．１標準曲線的建立??實時熒光定量ＰＣＲ的標準曲線是利用ＤＮＡ濃度的對數(shù)值對應相應的Ｃｑ值構建的。將０６１８??基因組ＤＮＡ的對數(shù)值作為橫坐標，以其相對應的Ｃｑ值作為縱坐標作圖，即可獲得一條基于Ｃｑ??值和ＤＮＡ濃度的回歸曲線，兩者呈現(xiàn)線性關系（圖３－５），其線性回歸方程為Ｙ＝－３．３６］Ｘ＋４１．９７１??其中Ｙ表示Ｃｑ值，Ｘ表示ＤＮＡ濃度的對數(shù)值，其相對應的相關系數(shù)（Ｒ２）為０．９９２，擴増效率??Ｅ值為９８．４％。根據(jù)實時熒光定量ＰＣＲ獲得的Ｃｑ值，通過回歸方程可以計算樣品中目標ＤＮＡ??的濃度，再根據(jù)公式計算可以得到相應的拷貝數(shù)。??２６??

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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[3]人參、西洋參和三七化學成分的研究[D]. 張崇喜.吉林農(nóng)業(yè)大學 2004

碩士論文
[1]三七根腐病病原真菌的初步研究[D]. 喬新國.云南大學 2015



本文編號：3522848