Dickeya dadantii引起的甘薯莖腐病是甘薯的一種毀滅性細菌病害,在國內(nèi)外均有發(fā)生。中國是最大的甘薯生產(chǎn)國,甘薯莖腐病嚴重損害甘薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。甘薯莖腐病病原菌被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》,但目前國內(nèi)外尚無針對D.dadantii的檢測方法。本研究基于Dickeya屬細菌全基因組序列,設(shè)計D.dadantii特異引物,建立特異靈敏的檢測甘薯莖腐病菌的方法。本研究通過基因組系統(tǒng)發(fā)育分析和基因組相似度比較確定了Dickye 屬內(nèi)各種細菌的分類地位,用基于細菌全基因組序列高通量設(shè)計引物的程序流程（Find Differential Primers Pipeline）和泛基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)種特有標志基因兩種方法設(shè)計D.dadantii特異引物,PCR檢測篩選出1對D.dadantii診斷引物Dad1-F（5’-CATATCAACCAGACCAGCCGTT）和 Dad1-R（5’-CGGCCTGCTTTTAAACAACGTATTA）,用該引物對能且只能從D.dadantii菌株中擴增到167-bp目的片段�；谠撎禺愐飳⒘顺Ｒ�(guī)PCR、實時熒光定量PCR和免疫... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２?ＬＡＭＰ引物位置（摘自宋玉財?shù)龋玻埃保叮??Ｆｉｇ．?１．２?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒｓ??２．６重組酶聚合酶擴增技術(shù)（ＲＰＡ）??

?＿的編碼基因）設(shè)計特異性引物，并在線預(yù)測引物的特異性，從２個基因分別獲得??一對引物（表２．７）。??３．２．２．３引物特異性驗證??選擇?Ｄ．?油７?ＮＣＰＰＢ?８９８ｔ、ＮＣＰＰＢ?２９７６ｔ?和?ＣＺ１５０１?與近緣菌株?Ｄ．??ＮＣＰＰＢ?４４７９、Ｚ）．?ｃ／／訓(xùn)ｒｔｏ／ｃｏ／ａ?ＮＣＰＰＢ?３５３０用于初篩由Ｄ．也也《＂／特有基因設(shè)計??的２對引物。只有引物對Ｄａｄ?１?－Ｆ／?Ｄａｄ?１－Ｒ（針對蛋白ＷＰ＿０７７２４５５１７的編碼基因）??的擴增結(jié)果呈現(xiàn)Ｄ．也也咐／／特異性，即只從３個Ｄ．而而咐／／菌株擴增得到１６７?ｂｐ??目的片段。將所得的３個ＰＣＲ產(chǎn)物回收測序，與目的片段序列對比分析相似度??達１００％，表明所得產(chǎn)物為目的片段。??進一步用Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄｌ－Ｒ從１９個菌株進行ＰＣＲ擴增，依然只從３個Ｄ．??而也扣／／菌株擴增得到１６７?ｂｐ目的片段，而從其他種屬菌株中沒有擴增出產(chǎn)物（圖??２．３），證實引物對Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄ?１－Ｒ是Ｄ．而而油７特異引物。??卜??

?第二章細菌性甘薯莖腐病菌ｄａｃ／ｃｒ？／／／的檢測??用引物Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄｌ－Ｒ以菌株ＣＺ１５０１的基因組ＤＮＡ為模板進行ＰＣＲ，能??從最低５０?ｐｇ．ｎＬ－１的ＤＮＡ中擴增到１６７?ｂｐ的目的條帶（圖２．４）。??ＪＭ??圖２．４瓊脂糖凝膠電泳示用Ｄ．心心咐／／特異引物從不同濃度基因組ＤＮＡ擴增的產(chǎn)物??Ｆｉｇ．?２．４?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｕｓｉｎｇ?ｔｈｅ?Ａ?＾＂“＂＂＂／／－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??１３．１．２常規(guī)ＰＣＲ方法檢測接種樣品??■囉??１６７?ｂｐ??（ｃ）??１６７?ｂｐ??圖２．５瓊脂糖凝膠電泳示用Ｚ）．心ｒｆｒｍｒｆ／特異引物從不同濃度土壤ＤＮＡ?（Ａ）、甘薯莖??ＤＮＡ?（Ｂ）、甘薯塊根ＤＮＡ?（Ｃ）擴增的產(chǎn)物??Ｆｉｇ．?２．５?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＤＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｓｏｉｌ?（Ａ），?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏ?ｓｔｅｍ?（Ｂ），?ａｎｄ?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏ?ｔｕｂｅｒ??（Ｃ）?ｕｓｉｎｇ?ｔｈｅ?Ｄ．?ｒｆｒｔ＾ｍ／／７－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??以接種樣品提取的ＤＮＡ為模板，采用常規(guī)ＰＣＲ方法進行靈敏度測定。如圖??２．５所示

【參考文獻】：
期刊論文
[1]甘薯莖腐病癥狀及其病原鑒定[J]. 沈肖玲,林釵,錢俊婷,仇智靈,陳江彬,孫超,易建平,樓兵干.  植物病理學(xué)報. 2018(01)
[2]甘薯莖腐病的發(fā)生危害及防控對策[J]. 楊曉,張敏榮,余繼華,盧璐,陶健.  農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2017(02)
[3]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)研究進展[J]. 宋玉財,王彬,王官曉,李鵬,劉洪明,于曉云,于小川,徐曉靜,王俊卿.  中國動物檢疫. 2016(06)
[4]細菌性軟腐病菌Dickeya致病機理的研究進展[J]. 周佳暖,姜子德,張煉輝.  植物病理學(xué)報. 2015(04)
[5]河北省甘薯莖腐病研究初報[J]. 高波,王容燕,馬娟,李秀花,陳書龍.  植物保護. 2015(03)
[6]免疫捕捉PCR和經(jīng)典PCR方法檢測水稻細菌性谷枯病菌靈敏性比較[J]. 羅金燕,陳磊,秦萌,趙玉強,余慧.  浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2014(02)
[7]甘薯莖腐病的研究進展[J]. 黃立飛,羅忠霞,房伯平,李開綿,陳景益,黃實輝.  植物保護學(xué)報. 2014(01)
[8]河南省甘薯莖腐病的分離與鑒定[J]. 秦素研,黃立飛,葛昌斌,劉志堅,張勇躍,李建國,房伯平.  作物雜志. 2013(06)
[9]中國甘薯產(chǎn)業(yè)及產(chǎn)業(yè)技術(shù)的發(fā)展與展望[J]. 馬代夫,李強,曹清河,鈕福祥,謝逸萍,唐君,李洪民.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2012(05)
[10]菊歐文氏菌分子檢測技術(shù)的研究[J]. 劉鵬,黃國明,劉勇,崔鐵軍.  植物病理學(xué)報. 2007(06)

博士論文
[1]泛基因組學(xué)分析方法開發(fā)及應(yīng)用[D]. 趙永兵.中國科學(xué)院北京基因組研究所 2014



本文編號：3475733