【背景】布尼亞病毒目（Bunyavirales）和正黏病毒科（Orthomyxoviridae）病毒從帽子結(jié)構(gòu)下游10—20個(gè)堿基處切割寄主mRNA,以5′端切割產(chǎn)物（帽子序列）作為引物起始自身基因組的轉(zhuǎn)錄,生成含一段異源帽子序列的病毒mRNA,這一過程稱為"抓帽"。水稻條紋病毒（rice stripe tenuivirus, RSV）是一種布尼亞病毒,其"抓帽"機(jī)制還不甚清楚�！灸康摹垦芯縍SV粗提物能否從溶液中的外源mRNA"抓帽",以建立一種便捷的體外體系,用于解析RSV"抓帽"和轉(zhuǎn)錄機(jī)制�！痉椒ā恳訮EG沉淀和超速離心法粗提RSV,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和質(zhì)譜技術(shù)分析粗提物成分。然后取少量粗提液,加入富含珠蛋白（globin）mRNA的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate,RCL）和合適濃度的金屬離子配制體外"抓帽"體系。待體外反應(yīng)結(jié)束,提取體系中總RNA,以巢式RT-PCR擴(kuò)增含珠蛋白-αmRNA帽子序列的RSV mRNA,并對(duì)其進(jìn)行克隆,通過序列分析比較RSV體外"抓帽"與體內(nèi)"抓帽"的異同�！窘Y(jié)果】從100 g感染R... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020,53(21)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

利用巢式RT-PCR擴(kuò)增RSV從珠蛋白-α“抓帽”后合成的NP（轉(zhuǎn)錄自v RNA3）和NCP（轉(zhuǎn)錄自vc RNA4)m RNA

從100 g感染RSV的水稻葉片獲得RSV粗提液2m L。取少量粗提液進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后可觀察到4條主要的蛋白條帶，分子量依次約250、50、30和11 k D（圖2）。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，條帶1主要為光系統(tǒng)II相關(guān)蛋白，條帶2主要為核酮糖1,5-二磷酸羧化酶（Ru Bis CO）大亞基和Ru Bis CO活化酶，條帶3主要為RSV的NP，條帶4主要為Ru Bis CO小亞基。由這些結(jié)果可知，RSV粗提物含大量雜質(zhì)，而葉綠體是雜質(zhì)成分的重要來源。RNA1編碼的Rd Rp也是RSV的結(jié)構(gòu)蛋白[31]，但可能因?yàn)楹刻�，未觀察到該蛋白對(duì)應(yīng)的條帶。2.2 RSV粗提物“抓帽”產(chǎn)物的檢測(cè)

為驗(yàn)證RSV需要識(shí)別帽子結(jié)構(gòu)才能利用溶液中的m RNA作為帽子序列供體，在反應(yīng)體系中加入了不同濃度的帽子結(jié)構(gòu)類似物m7G (5′) ppp (5′) G。如圖3-B所示，m7G (5′) ppp (5′) G明顯減少含珠蛋白-αm RNA帽子序列的NCP的生成。當(dāng)m7G (5′) ppp (5′) G濃度為1.5 mmol·L-1時(shí)，目的條帶基本消失。相反，m7G (5′) ppp (5′) G對(duì)反應(yīng)后的RSV基因組RNA的檢出性沒有影響，表明m7G (5′) ppp (5′) G不會(huì)造成反應(yīng)體系中RNA的降解。2.3 RSV粗提物“抓帽”產(chǎn)物分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]水稻條紋病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 張恒木,孫煥然,王華弟,陳劍平.  植物保護(hù)學(xué)報(bào). 2007(04)

碩士論文
[1]水稻條紋病毒mRNA 5’端“額外AC”的來源研究[D]. 和思淼.福建農(nóng)林大學(xué) 2019



本文編號(hào)：3466819