近年來,煙曲霉（Aspergillus fumigatus）對三唑類抗真菌藥物的抗藥性的報道愈發(fā)頻繁,成為臨床醫(yī)學亟待解決的問題。農(nóng)用三唑類殺菌劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),明確農(nóng)用唑類殺菌劑的使用與臨床抗性菌株的產(chǎn)生之間的關(guān)系,具有重要意義。本文從浙江省各地蔬菜大棚中分離得到4株敏感型野生煙曲霉（A.fumigatus）,通過戊唑醇誘導(dǎo),4株敏感型野生煙曲霉均降低了對三唑類醫(yī)藥伏立康唑和伊曲康唑的敏感性,特別是對伏立康唑產(chǎn)生了較高的抗性（MIC=16 mg/L）。通過對誘導(dǎo)抗性菌株cyp51A基因的測序,發(fā)現(xiàn)由戊唑醇誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的4株菌株,cyp51A基因均發(fā)生TR46/Y121F/T289A突變。這一結(jié)果表明,戊唑醇等農(nóng)用三唑類殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期使用,可以誘導(dǎo)環(huán)境中的敏感型野生煙曲霉產(chǎn)生cyp51A突變（TR46/Y121F/T289A）,導(dǎo)致其對三唑類藥物的抗性。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含TR46/Y121F/T289A突變的轉(zhuǎn)化子,對比不含突變的轉(zhuǎn)化子,含TR46/Y121F/T289A突變的轉(zhuǎn)化子其對三唑類醫(yī)藥的抗性達到與誘導(dǎo)菌株相同的水平,即伏立康唑MIC=16mg/L,伊曲康唑... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 文獻綜述
    1.1 煙曲霉及其致病性
    1.2 三唑類抗真菌藥物及其抗藥性
    1.3 煙曲霉抗藥性機制
        1.3.1 cyp51A基因突變
        1.3.2 非cyp51A基因突變
    1.4 煙曲霉抗性獲得途徑
    1.5 本研究的提出和意義
第2章 戊唑醇誘導(dǎo)的煙曲霉對藥物的抗性
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 藥品和試劑
        2.2.2 儀器和設(shè)備
        2.2.3 培養(yǎng)基
        2.2.4 菌種
    2.3 實驗方法
        2.3.1 煙曲霉菌株的分離與鑒定
        2.3.2 戊唑醇誘導(dǎo)煙曲霉抗性實驗
        2.3.3 誘導(dǎo)后煙曲霉菌株對伏立康唑、伊曲康唑的MIC變化
        2.3.4 誘導(dǎo)菌株cyp51A基因的變化
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 煙曲霉的鑒定
        2.4.2 戊唑醇誘導(dǎo)煙曲霉抗性
        2.4.3 誘導(dǎo)抗性菌株cyp51A基因的變化
    2.5 小結(jié)
第3章 CYP51A基因TR_(46)/Y121F/T289A突變與煙曲霉抗性的關(guān)系
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 化學試劑與抗生素
        3.2.2 儀器和設(shè)備
        3.2.3 培養(yǎng)基和緩沖液
        3.2.4 質(zhì)粒和菌種
    3.3 實驗方法
        3.3.1 載體構(gòu)建流程示意
        3.3.2 構(gòu)建中間載體質(zhì)粒pBC-hygro-cyp51A
        3.3.3 表達載體pBC-hygro-cypbox的構(gòu)建
        3.3.4 煙曲霉電擊轉(zhuǎn)化試驗
        3.3.5 煙曲霉轉(zhuǎn)化子的鑒定與分析
        3.3.6 轉(zhuǎn)化子的MIC變化和cyp51A序列測序
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 構(gòu)建中間載體質(zhì)粒pBC-hygro-cyp51A
        3.4.2 表達載體pBC-hygro-cypbox的構(gòu)建
        3.4.3 煙曲霉轉(zhuǎn)化子的鑒定與分析
        3.4.4 轉(zhuǎn)化子的MIC變化
    3.5 小結(jié)
第4章 煙曲霉抗性菌株CYP51A基因表達變化
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 總RNA的提取及完整性檢測
        4.3.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄及驗證
        4.3.3 熒光定量法測定煙曲霉抗性菌株和敏感菌株cyp51A基因的變化
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 RNA樣品質(zhì)量檢測
        4.4.2 內(nèi)參基因片段的普通PCR擴增
        4.4.3 目的基因引物的選擇
        4.4.4 Cyp51A基因的熒光定量PCR分析
    4.5 小結(jié)
第5章 抗藥性與代謝作用的相關(guān)性及其遺傳穩(wěn)定性
    5.1 引言
    5.2 試驗材料
        5.2.1 藥品和試劑
        5.2.2 儀器和設(shè)備
        5.2.3 培養(yǎng)基和緩沖液
    5.3 實驗方法
        5.3.1 抗性煙曲霉菌株對伏立康唑的代謝
        5.3.2 恢復(fù)敏感性
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 煙曲霉對伏立康唑的代謝
        5.4.2 恢復(fù)敏感性
    5.5 小結(jié)
第6章 結(jié)論
參考文獻
攻讀碩士學位期間主要的研究成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]煙曲霉關(guān)鍵致病因子研究進展[J]. 賈震宇,李德東,姜遠英,王彥.  中國真菌學雜志. 2013(04)
[2]三唑類化合物研究與應(yīng)用[J]. 白雪.  化工之友. 2007(07)
[3]唑類農(nóng)藥研究進展[J]. 金林紅,宋寶安,楊松,胡德禹,劉剛.  貴州大學學報(自然科學版). 2003(01)
[4]微生物麥角固醇的研究進展[J]. 何秀萍,張博潤.  微生物學通報. 1998(03)



本文編號：3459767