褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）是一種吸食水稻汁液的害蟲(chóng),常對(duì)水稻產(chǎn)量造成毀滅性打擊。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中,通過(guò)大量使用殺蟲(chóng)劑來(lái)防治褐飛虱,但這僅是治標(biāo)不治本,更易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。發(fā)掘抗性基因、培育抗性水稻品種是公認(rèn)最為經(jīng)濟(jì)有效、環(huán)境友好的褐飛虱防治手段。至今為止,已經(jīng)在稻種資源中發(fā)掘鑒定了 30多個(gè)抗褐飛虱基因,但現(xiàn)有研究中對(duì)其抗蟲(chóng)機(jī)理的了解甚少。本文在前人克隆水稻抗褐飛虱基因BPH9的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)其抗性機(jī)制進(jìn)行了探索,所得結(jié)果如下:1、通過(guò)收集褐飛虱唾液蛋白,利用質(zhì)譜測(cè)序方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,構(gòu)建了水稻褐飛虱唾液蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究共鑒定到161個(gè)蛋白,蛋白注釋結(jié)果表明酶類蛋白在鑒定出的唾液蛋白中所占比例最高。GO分析表明褐飛虱唾液蛋白主要參與生物反應(yīng)過(guò)程、分子功能的發(fā)揮與細(xì)胞組分的形成。2、為篩選BPH9基因所識(shí)別的效應(yīng)子,本論文共獲得了 120個(gè)褐飛虱唾液蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA克隆,分析了其是否具有信號(hào)肽及可能的信號(hào)肽切割位點(diǎn),分別構(gòu)建了以pEarleyGate100為骨架的載體。通過(guò)將這些候選效應(yīng)子與BPH9共轉(zhuǎn)煙草進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)未能得到能特異性激活BPH9... 

【文章來(lái)源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 水稻的重要性
    1.2 水稻褐飛虱研究概況
        1.2.1 水稻褐飛虱的生物學(xué)特征和抗性機(jī)理
            1.2.1.1 水稻褐飛虱的生物學(xué)特征
            1.2.1.2 水稻對(duì)褐飛虱的抗性機(jī)理
        1.2.2 褐飛虱對(duì)水稻的危害
        1.2.3 水稻抗褐飛虱基因的定位與克隆
    1.3 植物抗蟲(chóng)防御機(jī)制
        1.3.1 組成型防御機(jī)制
            1.3.1.1 物理性防御
            1.3.1.2 化學(xué)性防御
        1.3.2 誘導(dǎo)型防御機(jī)制
            1.3.2.1 HTI
            1.3.2.2 ETI
    1.4 效應(yīng)子的研究概況
        1.4.1 效應(yīng)子的一般特征
        1.4.2 昆蟲(chóng)效應(yīng)子研究現(xiàn)狀與發(fā)展
    1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)
    1.6 蛋白的亞細(xì)胞定位
        1.6.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)候選效應(yīng)子的亞細(xì)胞定位
        1.6.2 原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)融合蛋白的亞細(xì)胞定位
    1.7 蛋白質(zhì)相互作用
        1.7.1 酵母雙雜交體系
        1.7.2 Pull-down技術(shù)
        1.7.3 串聯(lián)親和純化技術(shù)
        1.7.4 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)
        1.7.5 免疫共沉淀(CoIP)
    1.8 本研究的目的意義
第二章 褐飛虱唾液蛋白質(zhì)組研究
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.2.1.1 供試褐飛虱
            2.2.1.2 實(shí)驗(yàn)溶液、培養(yǎng)基
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.2.1 褐飛虱唾液與口針鞘的收集
            2.2.2.2 樣品蛋白的提取與純化
            2.2.2.3 蛋白樣品的SDS-PAGE檢測(cè)
            2.2.2.4 質(zhì)譜測(cè)序
            2.2.2.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 蛋白樣品的SDS-PAGE檢測(cè)
        2.3.2 質(zhì)譜測(cè)序結(jié)果初步分析
        2.3.3 褐飛虱唾液蛋白的生物信息學(xué)分析
    2.4 小結(jié)與討論
第三章 抗褐飛虱基因BPH9效應(yīng)子的篩選
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.2.1.1 供試褐飛虱
            3.2.1.2 煙草材料
            3.2.1.3 菌株、載體
            3.2.1.4 實(shí)驗(yàn)溶液、培養(yǎng)基
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.2.1 大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
            3.2.2.2 堿裂解提取質(zhì)粒法
            3.2.2.3 目的基因pEarleyGate100載體的構(gòu)建
            3.2.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備
            3.2.2.5 目的基因電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
            3.2.2.6 煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.7 臺(tái)盼藍(lán)染色
            3.2.2.8 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.9 候選效應(yīng)子對(duì)INF1引起的免疫反應(yīng)的抑制
            3.2.2.10 候選效應(yīng)子的亞細(xì)胞定位
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 目的基因的獲得
        3.3.2 BPH9基因不同骨架載體對(duì)細(xì)胞死亡現(xiàn)象的影響
        3.3.3 BPH9基因特異效應(yīng)子的篩選
        3.3.4 候選效應(yīng)子基因功能的初步分析
            3.3.4.1 候選效應(yīng)子的生物信息學(xué)分析
            3.3.4.2 臺(tái)盼藍(lán)染色
            3.3.4.3 Luciferase檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
            3.3.4.4 對(duì)PT-PCD的抑制作用
        3.3.5 候選效應(yīng)子的亞細(xì)胞定位
            3.3.5.1 候選效應(yīng)子亞細(xì)胞定位的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)
            3.3.5.2 原生質(zhì)體融合蛋白表達(dá)亞細(xì)胞定位
    3.4 小結(jié)與討論
第四章 BPH9基因互作蛋白篩選
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            4.2.1.1 菌株、載體
            4.2.1.2 酵母文庫(kù)
            4.2.1.3 cDNA模板
            4.2.1.4 實(shí)驗(yàn)溶液、培養(yǎng)基
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.2.2.1 水稻總RNA提取
            4.2.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成
            4.2.2.3 誘餌蛋白基因的擴(kuò)增與載體構(gòu)建
            4.2.2.4 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
            4.2.2.5 酵母表達(dá)檢測(cè)
            4.2.2.6 對(duì)照實(shí)驗(yàn)
            4.2.2.7 自激活與毒性檢測(cè)
            4.2.2.8 酵母篩庫(kù)
            4.2.2.9 部分陽(yáng)性克隆的測(cè)序
            4.2.2.10 候選蛋白基因的獲得與載體構(gòu)建
            4.2.2.11 候選蛋白在酵母真核細(xì)胞中的互作驗(yàn)證
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 酵母雙雜交篩選水稻9311、NIL9-9311文庫(kù)
        4.3.2 篩庫(kù)陽(yáng)性克隆初步分析
        4.3.3 候選蛋白酵母互作驗(yàn)證
    4.4 小結(jié)與討論
第五章 總結(jié)與討論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄一 質(zhì)譜鑒定到的褐飛虱唾液蛋白
    附錄二 候選效應(yīng)子列表
作者簡(jiǎn)介與在讀期間發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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