由蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali）引起的蘋果樹腐爛病,是蘋果上的一種毀滅性真菌病害。一旦病菌侵入到蘋果樹枝干的韌皮部和木質(zhì)部,生產(chǎn)上只能利用外科手術(shù)及化學(xué)藥劑進(jìn)行防治,但是化學(xué)藥劑由于很難達(dá)到樹皮和樹干深層,無法很好的控制病害,從而導(dǎo)致生產(chǎn)上嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失。因此,解析蘋果黑腐皮殼菌的致病機(jī)制對于開發(fā)新的腐爛病防治策略具有重要意義。病原菌通過G蛋白所調(diào)控的cAMP/PKA（the cyclic AMP/protein kinase A）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對外界的變化做出改變,從而調(diào)控病原真菌的致病性。G蛋白,G蛋白調(diào)控因子（RGS）,以及PKA是G蛋白-cAMP-PKA信號通路的三個重要組成部分。本論文借助蘋果黑腐皮殼菌全基因組測序信息,對蘋果黑腐皮殼菌G蛋白α亞基、RGS和蛋白激酶A的兩個催化亞基開展研究,明確它們在蘋果黑腐皮殼菌生長發(fā)育以及侵染致病等過程中的作用。該研究為全面揭示蘋果黑腐皮殼菌的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ),進(jìn)而為制定蘋果樹腐爛病防治新策略,提供重要的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.蘋果黑腐皮殼菌G蛋白α亞基Gvm2和Gvm3基因的鑒定和功能分析G蛋白可以通過調(diào)控cAMP/... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

異三聚體蛋白信號途徑模式（Lietal.2007）

圖2-1基于同源重組的基因敲除和四對引物PCR檢測轉(zhuǎn)化子示意圖Fig.2-1GeneknockoutbyhomologousrecombinationandPCRscreeningoftransformantswithfourpairprimers.2.3.2.2Double-jointPCR方法構(gòu)建敲除載體為了檢驗Gα蛋白的生物學(xué)功能，我們擬生成三個基因Gvm1，Gvm2和Gvm3的敲除突變體。我們使用Double-jointPCR的方法構(gòu)建基因敲除盒（Yuetal.2014）。根據(jù)蘋果黑腐皮殼菌基因組數(shù)據(jù)庫中基因兩側(cè)的基因組DNA序列，分別選取開放閱讀框上游與下游各1kb左右的DNA序列作為同源重組時的上臂和下臂，構(gòu)建基因敲除體系。以03-8基因組DNA為模板分別用引物對Gvm1-1F/Gvm1-2R，Gvm1-3F/Gvm1-4R，Gvm2-1F/Gvm2-2R，Gvm2-3F/Gvm2-4R和Gvm3-1F/Gvm3-2R，Gvm3-3F/Gvm3-4R擴(kuò)出上游片段L1和下游片段L2，以攜帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hph）的質(zhì)粒PHIG2RHPH2-GFP-GUS為模板用引物HYG-F/HYG-R擴(kuò)增hph基因片段，并膠回收PCR產(chǎn)物。接著用Double-jointPCR方法將3段片段連接在一起，構(gòu)建敲除片段。構(gòu)建好的敲除片段轉(zhuǎn)化進(jìn)入野生型菌株03-8通過同源重組實現(xiàn)基因敲除。2.3.2.3野生型蘋果黑腐皮殼菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化（1）將03-8野生型菌株接種到鋪玻璃紙的PDA平板上，25℃培養(yǎng)2d。將菌絲刮成小塊接種到含有100mlYEPD液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，25℃，110rpm培養(yǎng)36h。（2）用無菌濾布過濾收集菌絲，稱量菌絲并加入酶解液（0.7g菌絲/10ml酶解液）。（3）放置于搖床上30℃，90rpm搖約2-2.5h。（4）顯微鏡下觀察，酶解完成后，上面放兩層擦鏡紙下面放一層無菌濾布過濾酶解混合物到無菌的50ml離心管中，再用1.2M的KCl沖洗，以便將原生質(zhì)體盡可能多的洗下來，用KCl定容至50ml。（5）室溫4500rpm離心10min。（6）棄上清，加入15mlSTCBuffer用移液槍輕微的重新懸浮，4

圖2-2接種位置示意圖Fig.2-2Inoculatelocationdiagram.2.3.8胞內(nèi)cAMP濃度和PKA活性分析收集YEPD搖培3d的菌絲體，液氮冷凍。樣品的cAMP濃度由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司采用HPLC方法測定。數(shù)據(jù)分析采用SAS軟件包（SASInstitute,Cary,USA）平均數(shù)差異顯著性t檢驗分析，p<0.05。收集YEPD搖培3d的菌絲體用于PKA活性檢測，液氮研磨0.3g的菌絲樣品。PKA活性檢測使用PepTag非放射性蛋白激酶檢測系統(tǒng)(Promega,Madison,USA)測定。測定樣品用1.2%的瓊脂糖凝膠160V電壓跑15min。紫外透照器檢測。2.4試驗結(jié)果2.4.1G蛋白α亞基序列分析與比較根據(jù)M.oryzaeMagA,MagB和MagCGα亞基蛋白序列分別在蘋果黑腐皮殼菌轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫中Blast比對分析，共找到3個異源三聚體G蛋白的Gα亞基，命名為Gvm1(VM1G_00876),Gvm2(VM1G_09956)和Gvm3(VM1G_04248)。Gvm1基因編碼含353個氨基酸的多肽包括3個內(nèi)含子，與稻瘟病菌的MAGB(AF011341)有98.6%的相似性，與粗糙脈孢菌的GNA-1(XP957133)有98.3%的相似性，與釀酒酵母Gpa1(NP011868)有28.5%的相似性。Gvm2基因編碼含357個氨基酸的多肽包括4個內(nèi)含子，與稻瘟病菌的MAGC(AF011342)有82.7%的相似性，與粗糙脈孢菌的GNA-2(Q05424)有81.0%的相似性。Gvm3基因編碼含355個氨基酸的多肽包括5個內(nèi)含子，與稻瘟病菌的MAGA(AF011340)有89.9%的相似性，與粗糙脈孢菌的GNA-3(XP962205)有85.4%的相似性，與釀酒酵母Gpa2(NP010937)有40.1%的相似性（圖2-3A）。不同的異源三聚體G蛋白α亞基的系統(tǒng)發(fā)育樹分為三個組群：組群I，組群II和組21

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]陜西渭北地區(qū)蘋果樹腐爛病發(fā)生情況調(diào)查[J]. 李正鵬,高小寧,杜戰(zhàn)濤,胡楊,康振生,黃麗麗.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2013(01)
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[7]陜西渭北地區(qū)盛果期蘋果樹腐爛病調(diào)查研究[J]. 馬志峰,王榮花,劉文國,康克功,高平文.  北方園藝. 2007(10)
[8]蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)及其影響條件研究[J]. 臧睿,黃麗麗.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2007(01)
[9]陜北地區(qū)蘋果樹腐爛病防治建議[J]. 王金友.  西北園藝(果樹). 2006(02)
[10]陜西省關(guān)中地區(qū)蘋果樹腐爛病調(diào)查初報[J]. 王磊,臧睿,黃麗麗,謝芳琴,高小寧.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2005(S1)

博士論文
[1]中國蘋果樹腐爛病菌的種類：rDNA-ITS序列和表型比較研究[D]. 王旭麗.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2007

碩士論文
[1]蘋果樹腐爛病菌三個果膠酶基因的致病功能研究[D]. 許春景.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016
[2]蘋果樹腐爛病菌4個多聚半乳糖醛酸酶基因功能的初步研究[D]. 宋娜.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2014
[3]蘋果樹腐爛病菌致病物質(zhì)的初步研究[D]. 王建華.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2012
[4]陜西蘋果樹腐爛病菌不同分離株生物學(xué)特性及致病性研究[D]. 臧睿.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2006



本文編號：3434343