華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita Faldermann）隸屬鞘翅目,鰓金龜科,其幼蟲蠐螬,是花生、大豆、小麥、玉米、馬鈴薯等作物的重要地下害蟲,危害嚴(yán)重,防治困難。采用“地下害蟲,地上防治”、“防治成蟲,控制幼蟲”的策略,尋找一種高效、無污染的華北大黑鰓金龜成蟲防治新途徑已成為當(dāng)務(wù)之急,其中利用寄主植物的揮發(fā)物誘殺成蟲是目前華北大黑鰓金龜防治的一種潛在綠色防控技術(shù)。本文以闡明其成蟲觸角中兩種氣味結(jié)合蛋白（HoblOBP1和HoblOBP2）的互作能增強對氣味化合物的結(jié)合能力為目標(biāo);通過熒光原位雜交技術(shù)證明了HoblOBP1和HoblOBP2在成蟲觸角中的共表達;利用蛋白分子對接技術(shù)對兩蛋白的結(jié)合模式及其兩蛋白復(fù)合物與氣味分子的關(guān)鍵結(jié)合位點進行預(yù)測與分析;采用定點突變技術(shù),獲得特定的突變基因,進而表達純化以獲得不同的突變蛋白;通過熒光結(jié)合實驗明確不同結(jié)合位點在HoblOBP1/OBP2復(fù)合物識別活性氣味分子中的影響,從而解析OBPs異源二聚體的形成機制及其對氣味分子的識別機制。主要研究結(jié)果如下:1.熒光原位雜交實驗表明HoblOBP1和HoblOBP2在華北大黑鰓金龜... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

華北大黑鰓金龜?shù)纳芷贔igure1-1LifecycleofHolotrichiaoblita

（15）再接著用 200mL 滅菌水洗 3min，常溫下在搖床上進行。（16）配制顯色劑：在室溫下，按順序依次將 10mL AP-Buffer，66uL NBT，33uL BCIP 加入50mL 離心管中，在黑暗中攪拌至均勻。在每張載玻片上加入 1mL 的顯色劑并蓋上蓋玻片，放在藍色板上，在搖床上染色 1h（搖床上，轉(zhuǎn)速從 0 開始，慢慢進行，注意避光）。（17）染色后，用 1×TBST 在玻璃皿中洗 3 次，最后取出組織玻片，用衛(wèi)生紙吸干玻片，向組織切片上加入 100uL PBS/甘油（PBS:甘油=1:2），蓋上蓋玻片，正面向上放在藍板上，短期內(nèi)置于 4℃冰箱中保存。（18）第二天，從 4℃中取出已洗好的組織切片，用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀測華北大黑鰓金龜 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在觸角組織中表達的熒光信號。2.2 結(jié)果與分析熒光原位雜交技術(shù)檢測利用不同熒光素標(biāo)記探針的 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在華北大黑鰓金龜成蟲觸角感器中的共表達（圖 2-1）。其中熒光素 FTIC 和 Cy3 分別標(biāo)記探針 HoblOBP1 和HoblOBP2，在熒光顯微鏡下 HoblOBP1 和 HoblOBP2 探針標(biāo)記的細胞分別呈現(xiàn)綠色熒光信號和紅色熒光信號（圖 2-1 B、E 和 C、F）。熒光雜交后，熒光素標(biāo)記的基因在細胞中是可見，從圖 2-1D、G、H 中可以看到 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在觸角感器細胞中共表達。

圖 3-1 華北大黑鰓金龜 OBP1、OBP2 和 OBP1/OBP2 配體結(jié)合口袋的預(yù)測Figure 3-1 Prediction ligand binding pocket of the OBP1, OBP2, OBP1/OBP2 in H. oblita3.2.1.2 HoblOBP1、HoblOBP2 和 HoblOBP1/OBP2 蛋白復(fù)合物的配體結(jié)合口袋的比較從圖 3-1 中可以較清晰的看出 HoblOBP1、HoblOBP2 和 HoblOBP1/OBP2 配體結(jié)合口袋的置。從組成配體結(jié)合口袋的殘基數(shù)量來看，HoblOBP1 口袋最小，而 HoblOBP1/OBP2 的配體袋是最大的。其中 HoblOBP1/OBP2 復(fù)合物的口袋主要是由 HoblOBP2 提供的，但由于復(fù)合物袋還有一部分是由 HoblOBP1 提供的，兩蛋白之間的間隙也作為口袋一部分，使得復(fù)合物蛋白合口袋較HoblOBP2大一些。本實驗借助于分子模擬軟件Sybyl7.3中的分子對接模塊Surflex-Do（Jain, 2003）對蛋白與化合物的結(jié)合能力進行預(yù)測，其獲得分?jǐn)?shù)越高，表明結(jié)合能力越強Surflex-Dock 打分函數(shù)的結(jié)果顯示，四種配體與兩蛋白復(fù)合物的對接分?jǐn)?shù)均高于與 HoblOBP1HoblOBP2 對接的分?jǐn)?shù)（表 3-1），從而說明蛋白復(fù)合物與四種配體的結(jié)合活性高于單一蛋白的合活性，這與先前實驗結(jié)果一致（王冰，2013）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]暗黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析[J]. 房遲琴,張鑫鑫,劉丹丹,李克斌,張帥,曹雅忠,樊東,尹姣.  昆蟲學(xué)報. 2016(03)
[2]基于譜聚類的蛋白質(zhì)對接復(fù)合物最佳預(yù)測結(jié)構(gòu)的挑選方法[J]. 蔡磊鑫,陳榮,呂強.  小型微型計算機系統(tǒng). 2015(10)
[3]我國化學(xué)防治甘蔗金龜子研究進展[J]. 商顯坤,黃誠華,王伯輝.  南方農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2011(10)
[4]大田蠐螬的防治技術(shù)[J]. 張世忠.  農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2011(02)
[5]球孢白僵菌防治花生田蠐螬藥效試驗研究[J]. 陳正州,薛兆銀,周靖,徐家忠.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2011(04)
[6]綠僵菌與幾種藥劑防治花生蠐螬的比較試驗[J]. 李霞榮,張興桃,陳軍,劉領(lǐng),劉小陽.  宿州學(xué)院學(xué)報. 2011(02)
[7]綠僵菌CQMa128乳粉劑對蠐螬時間-劑量-死亡率模型分析[J]. 謝寧,王中康,張建偉,陳環(huán),殷幼平.  中國生物防治. 2010(04)
[8]植物揮發(fā)性信息化學(xué)物質(zhì)在昆蟲寄主選擇行為中的作用[J]. 戴建青,韓詩疇,杜家緯.  環(huán)境昆蟲學(xué)報. 2010(03)
[9]河北異小桿線蟲一品系的分類鑒定及其對蠐螬致病力的測定[J]. 劉樹森,李克斌,劉春琴,王慶雷,尹姣,曹雅忠.  昆蟲學(xué)報. 2009(09)
[10]河南部分地區(qū)花生田地下害蟲發(fā)生情況調(diào)查[J]. 羅宗秀,李克斌,曹雅忠,尹姣,張杰,張靜濤,尚光強.  植物保護. 2009(02)

博士論文
[1]華北大黑鰓金龜嗅覺相關(guān)蛋白互作機制研究[D]. 王冰.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013

碩士論文
[1]銅綠麗金龜氣味結(jié)合蛋白功能分析[D]. 趙瑩.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2014
[2]華北大黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白特異結(jié)合位點探討[D]. 莊緒靜.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012
[3]華北大黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白功能分析[D]. 鄧思思.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011
[4]金龜甲調(diào)查及其優(yōu)勢種性信息素鑒定與應(yīng)用研究[D]. 羅宗秀.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2010



本文編號：3430792