蘋果炭疽葉枯病是我國近幾年金冠系蘋果上發(fā)生流行的一種毀滅性病害,對蘋果產(chǎn)業(yè)造成巨大威脅。主要致病菌果生刺盤孢Colletotrichum fructicola易于產(chǎn)生子囊孢子。子囊孢子在該病害的田間流行及遠(yuǎn)距離傳播中發(fā)揮重要作用。本研究室前期從單個(gè)子囊中獲得兩類不同有性生殖方式單孢菌株:類型一（1104-7-WS）可以以同宗配合方式進(jìn)行完整有性生殖,產(chǎn)生發(fā)育良好子囊和子囊孢子;類型二（1104-6-B）以同宗配合方式進(jìn)行不完整有性生殖,子囊殼發(fā)育良好,子囊及子囊孢子偶見、發(fā)育不良。本研究擬以兩種不同表型的果生刺盤孢為供試菌株,基于基因敲入技術(shù)將熒光蛋白基因GFP、mCherry定點(diǎn)插入到組蛋白H1位點(diǎn)上,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核熒光標(biāo)記,并結(jié)合黑色素合成相關(guān)基因敲除,獲得白化突變體。通過對這些菌株的有性行為進(jìn)行研究,取得以下主要結(jié)果:1.將標(biāo)記GFP熒光基因的菌株1104-7-WSGfp與mCherry熒光基因的1104-6-BmCherry菌株對峙培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)菌株接觸處形成一條明顯“交配線”,鏡檢觀察到交配線的黑色顆粒物為子囊殼,內(nèi)含子囊及子囊孢子,交配線上子囊殼形成時(shí)間明顯早于類型一菌株,表... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

有性生殖過程

第一章 文獻(xiàn)綜述 7菌株雜交時(shí)，更有利于有性態(tài)的形成（張瑋 2015）。這與以前報(bào)道的小叢殼屬存在“ +”、“-”型菌株相似，其中 1104-7-WS 菌株相當(dāng)于“+”型菌株，而 1104-6-B株相當(dāng)于“-”型菌株。進(jìn)一步對 1104-7-WS、1104-6-B兩種菌株進(jìn)行基因組測序，發(fā)現(xiàn)兩種菌株均只有AT1-2-1 基因，而缺乏 MAT1-1-1 基因。而菌株 1104-7-WS 既能進(jìn)行同宗配合又能進(jìn)異宗配合，1104-6-B菌株可與 1104-7-WS 菌株雜交產(chǎn)生后代。所以將果生刺盤孢 C.ucticola 有性生殖歸結(jié)成一種非典型同宗配合。至于該菌株如何在不具有 MAT1-1-1因的條件下完成有性繁殖，及控制其同宗配合與異宗配合行為的遺傳因素目前尚未知。

在第一輪 PCR 擴(kuò)增中，使用引物對 P1/P2，擴(kuò)增出待融合片段 hisH1-U，片段大為 1.2 kb；使用 P3/P4 引物對，擴(kuò)增出 hisH1-D片段，大小為 1 kb；使用 P5/P6 引物，擴(kuò)增出 GFP-hp 片段，大小為 2.3 kb；使用 P7/P8 引物對，得到片段 pt，大小為.2 kb（圖 3-1A, Lane 1-4），和預(yù)期大小一致（董秋月等 2018）。在第二輪融合 PCR 擴(kuò)增中，使用引物對 P1Nest/P6Nest，獲得上游敲入片段 hisH1--GFP-hp，大小為 3.1 kb；使用引物對 P7Nest/P4Nest，獲得下游敲入片段 pt-hisH1-，大小為 2.2 kb（圖 3-1A, Lane 5-6），和預(yù)期大小一樣。使用 pEASYR-Blunt Zero Cloning Kit 克隆試劑盒，對融合片段 hisH1-U-GFP-hp 和t-hisH1-D 進(jìn)行克隆，得到重組質(zhì)粒 pEASYR-Blunt-Zero-hisH1-U-GFP-hp 和 pEASYR-lunt-Zero-pt-hisH1-D。對質(zhì)粒 pEASYR-Blunt-Zero-hisH1-U-GFP-hp 進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，切位點(diǎn)是 EcoRI 和 HindIII；對質(zhì)粒 pt-hisH1-D 進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切位點(diǎn)是 EcoRI XbaI（圖 3-1B），送到北京奧科生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建 GFP 表達(dá)體，且基因序列正確無誤。對于含有 mCherry的表達(dá)載體進(jìn)行敲入，其上游融合片段 hisH1-U-mCherry-hp 的建方法同 GFP，下游的融合片段 pt-hisH1-D 同 GFP的下游一樣。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于報(bào)告基因敲入構(gòu)建果生刺盤孢細(xì)胞核熒光標(biāo)記菌株[J]. 董秋月,梁曉飛,張瑋,孫廣宇,張榮.  菌物學(xué)報(bào). 2018(02)
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[6]陜西咸陽蘋果炭疽葉枯病的發(fā)生與防控[J]. 孫芳娟,查養(yǎng)良,李保華,高登濤,胡曉望.  中國果樹. 2015(01)
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[8]炭疽菌葉枯病在我國蘋果產(chǎn)區(qū)的發(fā)生分布及趨勢分析[J]. 黨建美,胡清玉,張瑜,王樹桐,曹克強(qiáng).  北方園藝. 2014(10)
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[10]蘋果炭疽葉枯病的發(fā)生與防治[J]. 王曉娥.  農(nóng)業(yè)科技通訊. 2014(03)

博士論文
[1]中國貴州、云南、廣西炭疽菌屬真菌多基因分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 楊友聯(lián).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010

碩士論文
[1]果生炭疽菌Colletotrichum fructicola有性生殖遺傳特性研究[D]. 張瑋.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016
[2]云南省部分觀賞植物葉面病原真菌的多樣性調(diào)查和系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 張艷敏.中國林業(yè)科學(xué)研究院 2012



本文編號：3402280