煙粉虱作為一種世界性害蟲,不僅可取食為害植物,還可傳播植物病毒病,并且極易對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性,這使得煙粉虱擁有極強(qiáng)的適應(yīng)性,成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大威脅。番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）是菜豆金色花葉病毒屬的代表種,引起的病毒病是全球番茄生產(chǎn)上最重要的病害之一,TYLCV由煙粉虱特異性傳播,研究二者的互作對于解析煙粉虱的傳毒機(jī)制十分關(guān)鍵。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類多功能的基因超家族,作為昆蟲代謝抗性中的新成員,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在昆蟲研究中備受關(guān)注。如今關(guān)于煙粉虱傳毒機(jī)制依然知之甚少,也沒有煙粉虱全基因組水平的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的報道,所以,探索TYLCV與煙粉虱的互作以及完成ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定和分析,可以幫助我們了解煙粉虱的傳毒機(jī)制和抗逆性機(jī)制,解釋煙粉虱強(qiáng)大的入侵性并指導(dǎo)害蟲防治工作。本論文通過泛素化的酵母膜系統(tǒng)對TYLCV與煙粉虱的互作展開研究,首先成功構(gòu)建了用于酵母雙雜交的煙粉虱cDNA文庫,利用TYLCV的外殼蛋白（CP）作為誘餌,首次成功從煙粉虱cDNA文庫中篩選得到了80個陽性克隆,進(jìn)一步利用該系統(tǒng)對這些候選蛋白與CP的互作進(jìn)行驗證,明確了20個煙粉虱蛋白與CP發(fā)生互作。在酵母雙雜交得到的抗... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

TYLCV基因組結(jié)構(gòu)圖（Gronenborn,2007）

能的重要途徑，目前酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)、pull-down、免疫共沉淀、噬菌都可用于蛋白質(zhì)互作研究，其中，酵母雙雜交是一種操作相對簡單、成本低且十分該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)與調(diào)控、信號傳導(dǎo)等領(lǐng)域的研究中。母雙雜交原理雙雜交系統(tǒng)最早是 Field 等人在 1989 年建立起來的，主要是用于明確蛋白之間相方法（Fields et al., 1989）。真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子一般由兩個結(jié)構(gòu)上可以分割且功域組成，其中，釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄因子包括轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation dNA 結(jié)合域（DNA-binding domain, BD）（Uetz，2012），BD 可以識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄激操縱子結(jié)構(gòu)，AD 通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來啟動下游基因，只有當(dāng) AD 和 BD 結(jié)合后用，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，酵母雙雜交技術(shù)就是利用這一特點(diǎn)開發(fā)而來的。當(dāng)兩個待于 AD 和 BD 結(jié)合，構(gòu)成的兩個融合載體分別稱為獵物載體和誘餌載體，兩個重組株中得到表達(dá)，只有兩個待測蛋白可以發(fā)生互作時，AD 和 BD 才可以在空間位置合，進(jìn)而激活下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)。目前，通過基因工程工具，已經(jīng)成改造為有直觀表癥的報告基因，這樣，通過報告基因能否正常表達(dá)可以直接判定兩否有互作關(guān)系。

業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引組成的小分子蛋白質(zhì)，常作為一種信號組分與其它蛋白質(zhì)相連，可被一種專一化的蛋白quitin specific protease, UBP）所識別并將與其相連的蛋白質(zhì)切割下來。根據(jù)泛素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)功能不變的前提下，將其分為 C 端（C terminal part of ubiquitin, Cub）和 N 端（N termif ubiquitin, Nub）的兩部分（Kittanakom et al., 2009）；然后把 Nub 的第 13 位氨基酸突變（NubG），這樣 Cub 和 Nub 就不能正常結(jié)合成為泛素，而 Cub 仍可以與-LexA-VP16 進(jìn)UBP 也就不能識別并水解與之結(jié)合的-LexA-VP16，下游報告基因的轉(zhuǎn)錄不能被激活，不到報告基因。將待檢測的兩個蛋白質(zhì)分別于 C 端和 N 端連接并在酵母中融合表達(dá)，蛋白可以互作，則會使分離的 NubG 和 Cub 空間拉近而結(jié)合形成完整的泛素，于是與之LexA-VP16 蛋白就可以被 UBP 水解下來，進(jìn)而激活下游報告基因。所以，通過檢測下游就可以判定待檢測兩個蛋白是否發(fā)生了互作。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3396428