抗菌肽作為先天免疫系統(tǒng)中的一個重要組成,在自然界許多生物中廣泛存在。近年來,由于病原菌耐藥性的出現(xiàn),使得抗菌肽得到越來越多的關(guān)注,但是在篩選新抗菌肽過程中仍存在一定難度�？莶菅堪麠U菌具有高效分泌表達(dá)蛋白的能力,本研究使用本實驗室建立的高效篩選抗菌肽的方法,利用枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)來篩選新抗菌肽。本研究利用枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建節(jié)節(jié)麥c DNA文庫,在文庫質(zhì)量評價后進(jìn)行文庫篩選,篩選依據(jù)是抗菌蛋白對宿主細(xì)胞造成損傷從而出現(xiàn)自溶現(xiàn)象,同時在掃描電鏡下可以觀察到候選蛋白菌株出現(xiàn)皺縮和穿孔等現(xiàn)象。本研究初步篩選得到37個抗菌蛋白。此外,利用硫酸銨法提取候選抗菌蛋白,觀察對細(xì)菌的抑制作用并再次篩選出對多種細(xì)菌有抑制作用的6個候選抗菌肽。本研究選擇2個具有廣譜抗性的候選抗菌肽繼續(xù)研究并利用二級結(jié)構(gòu)預(yù)測工具對篩選出來的6個候選抗菌肽進(jìn)行生物信息預(yù)測。本研究使用的2個抗菌肽同時具有α-螺旋和β-折疊,因此推測同時含有α-螺旋和β-折疊的肽抗菌活性更明顯。對2個候選抗菌肽進(jìn)行熱穩(wěn)定性實驗,結(jié)果表明,即使在100℃高溫處理下,2個抗菌肽仍具有抑菌活性。溶血性實驗結(jié)果表明,在最高濃度1000μg/m L處... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)示意圖(Petersetal2010)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位論文4圖1-2抗菌肽對細(xì)胞膜的影響示意圖(Ageitosetal2017)Fig.1-2Effectofantimicrobialpeptidesoncellmembrane(Ageitosetal2017)除了直接靶向病原體的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的這些抗菌肽之外，生物體內(nèi)還存在另一種抗菌肽，稱為宿主防御肽(hostdefensepeptides，HDPs)，這一類抗菌肽作為先天免疫系統(tǒng)中進(jìn)化保守的分子。宿主防御肽的目標(biāo)是廣泛的病原體，在宿主細(xì)胞的先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮出多功能作用(Mansouretal2014)。先天免疫是由多種細(xì)胞類型介導(dǎo)的，尤其是粘膜和皮膚表面的上皮細(xì)胞，它們是抵御病原體進(jìn)入的屏障。吞噬細(xì)胞存在于組織中，或從血液中移動到感染部位。先天免疫調(diào)節(jié)包括：（1）降低微生物特征分子產(chǎn)生的炎癥因子水平；（2）調(diào)節(jié)趨化因子、活性氧和活性氮的表達(dá)；（3）刺激血管生成；（4）促進(jìn)傷口愈合；（5）白細(xì)胞激活；（6）巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞分化等(Hilchieetal2013)。

利用枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行節(jié)節(jié)麥抗菌基因的克隆9菌IA751基因組整合了ComK基因得到菌株SCK6，通過木糖誘導(dǎo)的啟動子誘導(dǎo)ComK的表達(dá)，最終制備了可通過外源DNA和多聚體質(zhì)粒有效轉(zhuǎn)化的枯草芽胞桿菌SCK6超級感受態(tài)細(xì)胞(ZhangandZhang2011)。本研究使用的菌株就是枯草芽胞桿菌SCK6�？莶菅堪麠U菌表達(dá)系統(tǒng)可以將蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)分泌到細(xì)胞外，其分泌系統(tǒng)主要依賴于信號肽(SPs)的分泌途徑�？莶菅堪麠U菌至少存在四種分泌途徑：Sec分泌途徑、Tat分泌途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑和假菌絲蛋白輸出途徑(Tjalsmaetal2004)。假菌絲蛋白輸出途徑與枯草芽胞桿菌感受態(tài)形成有關(guān)(Chungetal1998)。大部分蛋白是通過Sec、Tac和ABC途徑分泌的(圖1-3)。雖然枯草芽白桿菌具有分泌蛋白的能力，但是蛋白的表達(dá)和分泌量卻不高，因此，研究分泌途徑的機(jī)制，有助于解決蛋白分泌量不高的問題(Wangetal2016)。圖1-3枯草桿菌分泌途徑的示意圖(LingLinetal2007)Fig.1-3SchematicofsecretionpathwayinB.subtilis(LingLinetal2007)雖然蛋白的分泌途徑不同，但是通過細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)都具有N-末端信號肽，其中包含三個不同的區(qū)域：一個帶正電荷的N-結(jié)構(gòu)域，一個疏水的H-結(jié)構(gòu)域，以及一個帶有信號肽酶切割位點的C-結(jié)構(gòu)域(PohlandHarwood2010)。當(dāng)信號肽把蛋白送到正確位置時，信號肽就會被特異性信號肽酶(SPPases)降解(Songetal2015)。不同的信號肽被不同的信號肽酶識別，因此也就有不同的信號識別位點(圖1-4)。


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