【目的】谷氧還蛋白（glutaredoxin, Grx）是生物體內(nèi)依賴硫醇的抗氧化酶,在生物氧化脅迫和細(xì)胞凋亡等許多重要的生命活動(dòng)中發(fā)揮作用。本研究旨在測(cè)定甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氧還蛋白家族成員SeGrx1的基因序列以及酶催化反應(yīng)特性,為揭示其在昆蟲(chóng)體內(nèi)功能奠定基礎(chǔ)�！痉椒ā恳郧捌讷@得的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),采用RACE-PCR技術(shù)克隆甜菜夜蛾Grx1基因cDNA全長(zhǎng)序列。將甜菜夜蛾Grx1基因的ORF序列連接至pET-16b原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichia coli BL21菌株中,IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)后用鎳柱和Superdex75/200分子篩純化;采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定純化的SeGrx1的活性及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)�！窘Y(jié)果】甜菜夜蛾SeGrx1基因（GenBank登錄號(hào):MK318813） cDNA全長(zhǎng)738 bp,其中5′非編碼區(qū)長(zhǎng)40 bp,3′非編碼區(qū)長(zhǎng)347 bp,開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)351 bp,編碼116個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子量為12.57 kD,活性位點(diǎn)為CPYC,為雙巰基谷氧還蛋白。SeGrx1中心由4個(gè)平行和反... 

【文章來(lái)源】：昆蟲(chóng)學(xué)報(bào). 2020,63(08)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

4種昆蟲(chóng)Grx1蛋白氨基酸序列比對(duì)

通過(guò)對(duì)甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的甜菜夜蛾Grx1基因片段進(jìn)行克隆,獲得SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列。結(jié)果顯示甜菜夜蛾SeGrx1基因cDNA全長(zhǎng)為738 bp(GenBank登錄號(hào): MK318813),其中5′非編碼區(qū)長(zhǎng)40 bp,3′非編碼區(qū)長(zhǎng)347 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為351 bp(圖1),編碼116個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為12.57 kD,等電點(diǎn)(pI)為8.45,不含信號(hào)肽序列。NCBI Blast數(shù)據(jù)顯示獲得的甜菜夜蛾谷氧還蛋白氨基酸序列隸屬于人類(lèi)GRX human class 1 and 2 (h_1_2)-like亞家族,與釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Grx1和Grx2氨基酸序列一致性分別為33.06%和31.47%,但是釀酒酵母Grx2在N端含有信號(hào)肽序列。因此,我們確認(rèn)本研究中獲得的甜菜夜蛾胱天蛋白酶為Grx1。甜菜夜蛾SeGrx1與鱗翅目昆蟲(chóng)家蠶Bombyx mori, 棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera和斜紋夜蛾Spodoptera litura的同源氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì),與家蠶BmGrx1同源性最高,序列一致性為81.03%,與斜紋夜蛾SlGrx1-like氨基酸序列一致性最低,為67.80%。它們都具有5個(gè)α螺旋4個(gè)β折疊等保守序列,含有經(jīng)典的KXXCPYC催化位點(diǎn)特征殘基,CPYC為雙巰基活性位點(diǎn),且只有這一個(gè)谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域,為雙巰基谷氧還蛋白(圖2)。

應(yīng)用MEGA7.0中的鄰接法,對(duì)甜菜夜蛾SeGrx1和其他11種昆蟲(chóng)的Grx1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。如圖所示,臍橙螟蛾Amyelois transitella和叢林斜眼褐蝶Bicyclus anynana Grxs聚為一個(gè)分支,同時(shí)又和甜菜夜蛾SeGrx1聚為同一分支,表明這3個(gè)物種在進(jìn)化上距離較近。利用DNAMAN翻譯的相應(yīng)氨基酸序列,輸入到STRING在線工具,預(yù)測(cè)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。因昆蟲(chóng)谷氧還蛋白研究本身較少,在選擇分類(lèi)時(shí),我們選擇人類(lèi)基因組進(jìn)行,輸入甜菜夜蛾SeGrx1的氨基酸序列,bit score最高的是人類(lèi)谷氧還蛋白2(GLRX2),與2.1節(jié)中三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)選擇人類(lèi)谷氧還蛋白2作為模板相一致。因此,以人類(lèi)谷氧還蛋白2作為模板進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明與目標(biāo)蛋白人類(lèi)谷氧還蛋白2存在已知、預(yù)測(cè)或其他相互作用關(guān)系的蛋白有硫氧還蛋白(TXN),谷氧還蛋白酶3和5(GLR3和GLR5),谷胱甘肽還原酶(GSR),磷脂過(guò)氧化氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4),硫氧化還蛋白2(TXN2),過(guò)氧化氫酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),以及過(guò)氧化物還原酶3和6(PRDX3和PRDX6),這些蛋白的主要功能具有相似性,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)而參與多種細(xì)胞生理過(guò)程,表明SeGrx2在保護(hù)昆蟲(chóng)組織免受氧化脅迫損傷中可能發(fā)揮重要作用。


本文編號(hào)：3344341