甜菜夜蛾谷氧還蛋白SeGrx1原核表達、純化及酶學性質(zhì)分析
發(fā)布時間：2021-08-15 10:03
【目的】谷氧還蛋白（glutaredoxin, Grx）是生物體內(nèi)依賴硫醇的抗氧化酶,在生物氧化脅迫和細胞凋亡等許多重要的生命活動中發(fā)揮作用。本研究旨在測定甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氧還蛋白家族成員SeGrx1的基因序列以及酶催化反應(yīng)特性,為揭示其在昆蟲體內(nèi)功能奠定基礎(chǔ)�！痉椒ā恳郧捌讷@得的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),采用RACE-PCR技術(shù)克隆甜菜夜蛾Grx1基因cDNA全長序列。將甜菜夜蛾Grx1基因的ORF序列連接至pET-16b原核表達載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichia coli BL21菌株中,IPTG誘導融合蛋白表達后用鎳柱和Superdex75/200分子篩純化;采用熒光酶標儀測定純化的SeGrx1的活性及酶促反應(yīng)動力學參數(shù)�！窘Y(jié)果】甜菜夜蛾SeGrx1基因（GenBank登錄號:MK318813） cDNA全長738 bp,其中5′非編碼區(qū)長40 bp,3′非編碼區(qū)長347 bp,開放閱讀框（ORF）全長351 bp,編碼116個氨基酸,預測蛋白的相對分子量為12.57 kD,活性位點為CPYC,為雙巰基谷氧還蛋白。SeGrx1中心由4個平行和反...
【文章來源】：昆蟲學報. 2020,63(08)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
4種昆蟲Grx1蛋白氨基酸序列比對
通過對甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的甜菜夜蛾Grx1基因片段進行克隆,獲得SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列。結(jié)果顯示甜菜夜蛾SeGrx1基因cDNA全長為738 bp(GenBank登錄號: MK318813),其中5′非編碼區(qū)長40 bp,3′非編碼區(qū)長347 bp,開放閱讀框(ORF)全長為351 bp(圖1),編碼116個氨基酸。預測蛋白分子質(zhì)量為12.57 kD,等電點(pI)為8.45,不含信號肽序列。NCBI Blast數(shù)據(jù)顯示獲得的甜菜夜蛾谷氧還蛋白氨基酸序列隸屬于人類GRX human class 1 and 2 (h_1_2)-like亞家族,與釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Grx1和Grx2氨基酸序列一致性分別為33.06%和31.47%,但是釀酒酵母Grx2在N端含有信號肽序列。因此,我們確認本研究中獲得的甜菜夜蛾胱天蛋白酶為Grx1。甜菜夜蛾SeGrx1與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyx mori, 棉鈴蟲Helicoverpa armigera和斜紋夜蛾Spodoptera litura的同源氨基酸序列進行多重比對,與家蠶BmGrx1同源性最高,序列一致性為81.03%,與斜紋夜蛾SlGrx1-like氨基酸序列一致性最低,為67.80%。它們都具有5個α螺旋4個β折疊等保守序列,含有經(jīng)典的KXXCPYC催化位點特征殘基,CPYC為雙巰基活性位點,且只有這一個谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域,為雙巰基谷氧還蛋白(圖2)。
應(yīng)用MEGA7.0中的鄰接法,對甜菜夜蛾SeGrx1和其他11種昆蟲的Grx1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。如圖所示,臍橙螟蛾Amyelois transitella和叢林斜眼褐蝶Bicyclus anynana Grxs聚為一個分支,同時又和甜菜夜蛾SeGrx1聚為同一分支,表明這3個物種在進化上距離較近。利用DNAMAN翻譯的相應(yīng)氨基酸序列,輸入到STRING在線工具,預測蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。因昆蟲谷氧還蛋白研究本身較少,在選擇分類時,我們選擇人類基因組進行,輸入甜菜夜蛾SeGrx1的氨基酸序列,bit score最高的是人類谷氧還蛋白2(GLRX2),與2.1節(jié)中三維結(jié)構(gòu)預測選擇人類谷氧還蛋白2作為模板相一致。因此,以人類谷氧還蛋白2作為模板進行相互作用網(wǎng)絡(luò)預測。預測結(jié)果表明與目標蛋白人類谷氧還蛋白2存在已知、預測或其他相互作用關(guān)系的蛋白有硫氧還蛋白(TXN),谷氧還蛋白酶3和5(GLR3和GLR5),谷胱甘肽還原酶(GSR),磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4),硫氧化還蛋白2(TXN2),過氧化氫酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),以及過氧化物還原酶3和6(PRDX3和PRDX6),這些蛋白的主要功能具有相似性,通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)而參與多種細胞生理過程,表明SeGrx2在保護昆蟲組織免受氧化脅迫損傷中可能發(fā)揮重要作用。
本文編號：3344341
【文章來源】：昆蟲學報. 2020,63(08)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
4種昆蟲Grx1蛋白氨基酸序列比對
通過對甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的甜菜夜蛾Grx1基因片段進行克隆,獲得SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列。結(jié)果顯示甜菜夜蛾SeGrx1基因cDNA全長為738 bp(GenBank登錄號: MK318813),其中5′非編碼區(qū)長40 bp,3′非編碼區(qū)長347 bp,開放閱讀框(ORF)全長為351 bp(圖1),編碼116個氨基酸。預測蛋白分子質(zhì)量為12.57 kD,等電點(pI)為8.45,不含信號肽序列。NCBI Blast數(shù)據(jù)顯示獲得的甜菜夜蛾谷氧還蛋白氨基酸序列隸屬于人類GRX human class 1 and 2 (h_1_2)-like亞家族,與釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Grx1和Grx2氨基酸序列一致性分別為33.06%和31.47%,但是釀酒酵母Grx2在N端含有信號肽序列。因此,我們確認本研究中獲得的甜菜夜蛾胱天蛋白酶為Grx1。甜菜夜蛾SeGrx1與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyx mori, 棉鈴蟲Helicoverpa armigera和斜紋夜蛾Spodoptera litura的同源氨基酸序列進行多重比對,與家蠶BmGrx1同源性最高,序列一致性為81.03%,與斜紋夜蛾SlGrx1-like氨基酸序列一致性最低,為67.80%。它們都具有5個α螺旋4個β折疊等保守序列,含有經(jīng)典的KXXCPYC催化位點特征殘基,CPYC為雙巰基活性位點,且只有這一個谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域,為雙巰基谷氧還蛋白(圖2)。
應(yīng)用MEGA7.0中的鄰接法,對甜菜夜蛾SeGrx1和其他11種昆蟲的Grx1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。如圖所示,臍橙螟蛾Amyelois transitella和叢林斜眼褐蝶Bicyclus anynana Grxs聚為一個分支,同時又和甜菜夜蛾SeGrx1聚為同一分支,表明這3個物種在進化上距離較近。利用DNAMAN翻譯的相應(yīng)氨基酸序列,輸入到STRING在線工具,預測蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。因昆蟲谷氧還蛋白研究本身較少,在選擇分類時,我們選擇人類基因組進行,輸入甜菜夜蛾SeGrx1的氨基酸序列,bit score最高的是人類谷氧還蛋白2(GLRX2),與2.1節(jié)中三維結(jié)構(gòu)預測選擇人類谷氧還蛋白2作為模板相一致。因此,以人類谷氧還蛋白2作為模板進行相互作用網(wǎng)絡(luò)預測。預測結(jié)果表明與目標蛋白人類谷氧還蛋白2存在已知、預測或其他相互作用關(guān)系的蛋白有硫氧還蛋白(TXN),谷氧還蛋白酶3和5(GLR3和GLR5),谷胱甘肽還原酶(GSR),磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4),硫氧化還蛋白2(TXN2),過氧化氫酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),以及過氧化物還原酶3和6(PRDX3和PRDX6),這些蛋白的主要功能具有相似性,通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)而參與多種細胞生理過程,表明SeGrx2在保護昆蟲組織免受氧化脅迫損傷中可能發(fā)揮重要作用。
本文編號：3344341
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