粘蟲Mythimna separata（Walker）隸屬鱗翅目夜蛾科,是一種典型的季節(jié)性遠(yuǎn)距離遷飛害蟲,也是嚴(yán)重威脅我國糧食作物生產(chǎn)安全的重大害蟲,廣泛分布于亞洲和澳洲的多個國家和地區(qū)。粘蟲在我國每年南北往返遷飛危害。近年來,由于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)變化,粘蟲的發(fā)生危害呈現(xiàn)加重趨勢,尤其是2012和2013年在全國范圍暴發(fā)成災(zāi),對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響。生物鐘基因是調(diào)控生物節(jié)律的一類基因,在細(xì)胞、組織、器官和行為等各層次中起作用。而粘蟲作為一種晝伏夜出性害蟲,其飛行、交配、產(chǎn)卵等行為均發(fā)生于夜晚,具有明顯的晝夜節(jié)律。但截至目前,有關(guān)其晝夜活動節(jié)律的分子調(diào)控機(jī)制尚未見報道。本研究首次對粘蟲4個生物鐘基因進(jìn)行了克隆,在此基礎(chǔ)上,通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析了相應(yīng)的表達(dá)模式,并就生物鐘基因?qū)φ诚x活動節(jié)律的調(diào)控進(jìn)行了進(jìn)一步研究。取得如下主要研究結(jié)果。1.根據(jù)粘蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫擴(kuò)增獲得4種粘蟲生物鐘基因period、timless、clock和cycle,分別命名為Msper（KY446805）、Mstim（KY446806）、Msclk（KY446807）、Mscyc（KY825136）,長度分別... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

粘蟲組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖 3-2 生物鐘基因 PCR 結(jié)果電泳圖Fig. 3-2 The PCR results of clock genes1-2: Msper，3: Mstim，4-6: Msclk，7-9: Mscyc3.2.2 氨基酸序列分析與進(jìn)化樹構(gòu)建Msper、Mstim、Msclk、Mscyc4 個生物鐘基因所編碼蛋白分子量分別為 132 kDa、117kDa、69 kDa、75 kDa，理論等電點分別為 6.50、5.14、5.63、6.74。四個蛋白均無信號肽且細(xì)胞定位結(jié)果表明，主要分布于分泌通路及線粒體外的其他部位。MsPER 具有保守的 PAS 及 PAC 結(jié)構(gòu)域并包含酸性氨基酸殘基（Asp + Glu）140 個，堿性氨基酸殘基（Arg + Lys）131 個。其蛋白質(zhì)疏水性最大值為 2.389，最小值為 3.556，其中有 98 個絲氨酸（Ser），53 個蘇氨酸（Thr），12 個酪氨酸（Tyr）可能被磷酸化。其預(yù)測二級結(jié)構(gòu) α-螺旋比例為 23.15%，β-折疊 2.16%，無規(guī)則卷曲 64.68%。經(jīng)軟件分析該蛋白質(zhì)無信號肽，細(xì)胞定位結(jié)果說明該蛋白主要分布于分泌通路及線粒體外的細(xì)胞6 7 89

3.3 粘蟲雌蛾生物鐘基因的表達(dá)模式分析3.3.1 定量片段的確認(rèn)以粘蟲頭部 cDNA 為模板，使用已合成的定量引物擴(kuò)增粘蟲生物鐘基因 Msper、Mstim、Msclk、Mscyc 及 β-Actin 定量片段。結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的 5 個片段長度分別為139 bp、139 bp、106 bp、168 bp、141 bp。片段序列測序結(jié)果表明，這 5 個片段序列與其對應(yīng)的 5 個粘蟲基因的 cDNA 序列一致性為 100%。3.3.2 定量引物特異性檢測采用實時熒光定量 PCR 體系，利用定量引物分別對粘蟲生物鐘基因 Msper、Mstim、Msclk、Mscyc 及內(nèi)參基因 β-Actin 進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線均為單峰（圖 3-5），表明這幾對定量引物的特異性較好，可進(jìn)一步用于基因定量試驗。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3302395