發(fā)布時(shí)間：2021-07-21 23:25

　　南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）是由介體白背飛虱（Sogatella furcifera,WBPH）進(jìn)行傳播的一種雙鏈RNA病毒,侵染水稻后植株嚴(yán)重矮縮,嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。目前,關(guān)于外殼蛋白P10在病毒侵染寄主水稻中的作用機(jī)制并不清楚。因此本研究通過酵母雙雜系統(tǒng)篩選與P10互作的寄主因子,進(jìn)一步研究這種互作關(guān)系在SRBSDV侵染過程中發(fā)揮怎樣的作用。本研究利用酵母雙雜交技術(shù),構(gòu)建誘餌質(zhì)粒p BT3-SUC-P10,利用酵母DUAL膜體系（DUAL membrane system）以水稻c DNA文庫為模板篩選與P10互作的寄主因子。進(jìn)一步對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行分析后,挑選3個(gè)與葉綠體相關(guān)的蛋白,并對(duì)其進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證,證明其在酵母中發(fā)生互作。利用免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation,Co-IP）技術(shù)在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中證實(shí)了Os PS1-L、Os PT3、Os LPA1與P10發(fā)生相互作用。在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明P10蛋白與Os PS1-L定位在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)上,與Os P... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

SRBSDV的病毒粒子[11]

中加入 100 μL 含有氨芐霉素抗性的 LB 液體培養(yǎng)基；（7）37 ℃，220 r min-1 震蕩培養(yǎng) 3 h，進(jìn)行菌落 PCR，挑選有條帶的樣品吸取 50 μL 送公司測(cè)序。2.3 結(jié)果與分析2.3.1 RT-PCR 擴(kuò)增 P10 全長(zhǎng)以 SRBSDV 侵染的水稻 c DNA 為模板，利用特異引物（表 2-1）對(duì)目的基因進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，約在 1700 bp 處出現(xiàn)與目的基因大小一致的條帶，電泳圖如 2-1 所示：

與南方水稻黑條矮縮病毒P10蛋白互作的寄主因子篩選及其對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)與功能影響的研究172.3.2誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建膜系統(tǒng)酵母表達(dá)載體pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N在Sfi1酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切后，與P10PCR產(chǎn)物一起切膠回收，二者連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，熱激孵育后涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取陽性克隆于含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，菌落PCR結(jié)果如圖2-2，送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與P10序列比對(duì)成功后，提取對(duì)應(yīng)菌液質(zhì)粒并酶切鑒定，結(jié)果如圖2-3所示，構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒經(jīng)酶切后在1700bp處有目標(biāo)條帶，表明P10成功連建到了膜系統(tǒng)酵母表達(dá)載體pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N上。圖2-2PCR檢測(cè)誘餌載體陽性克隆Fig.2-2PCRdetectionofbaitvectorpositiveclones圖2-3誘餌質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2-3Identificationofbaitplasmiddigestion2.3.3酵母膜系統(tǒng)功能驗(yàn)證在檢測(cè)膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)的功能時(shí)，如果誘餌蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)具有表達(dá)功能，便會(huì)依據(jù)誘餌蛋白的表達(dá)水平在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上有10%-100%的生長(zhǎng)率。而自激活檢測(cè)的SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上，應(yīng)觀察不到顯著的生長(zhǎng)。在陽性對(duì)照的表2-2反應(yīng)1中，pTSU2-APP與pNubG-Fe65具有強(qiáng)相互作用，而作為陰性對(duì)照的pTSU2-APP與pPR3N在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上的生長(zhǎng)顯著少于陽性對(duì)照。檢測(cè)誘餌基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)載體pBT3-N-P10在SD-THL篩選平板上生長(zhǎng)較好但在SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上生長(zhǎng)較少，而pBT3-


本文編號(hào)：3295971