內(nèi)生真菌在植物抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)內(nèi)生真菌的多樣性、生態(tài)分布以及生態(tài)功能等方面的研究較多,而對(duì)內(nèi)生真菌在植物中侵染定殖規(guī)律的報(bào)道較少。本研究以前期篩選的枸杞高活性拮抗內(nèi)生真菌Fusarium nematophilum NQ8GII4為材料,通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化NQ8GII4菌株原生質(zhì)體制備條件;利用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,構(gòu)建GFP標(biāo)記的NQ8GII4菌株遺傳轉(zhuǎn)化體系;通過(guò)表型、拮抗活性、致病性、熒光強(qiáng)度以及PCR檢測(cè),篩選與野生型相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化子;在此基礎(chǔ)上,利用GFP標(biāo)記的NQ8GII4轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液灌根處理枸杞植株,明確NQ8GII4菌株在枸杞中的定殖情況及對(duì)枸杞促生抗病的影響。研究結(jié)果如下:1、通過(guò)單因素試驗(yàn)考察菌齡（12～20 h）、酶解時(shí)間（0.5～3 h）、酶質(zhì)量濃度（15～35 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶）、穩(wěn)滲劑濃度（0.6～1.2 mol/L NaCl）等4個(gè)因素對(duì)NQ8GII4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量、再生率和有效原生質(zhì)體量的影響。采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體制備和再生條件。結(jié)果表明,確定酶解時(shí)間,... 

【文章來(lái)源】：寧夏大學(xué)寧夏回族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－５各因素交互作用對(duì)枸杞內(nèi)生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量（Ａ，？Ａ３）、再生率（Ｂ＾Ｂ；）、有效原生質(zhì)??體量（Ｃｉ？Ｃ３）影響的響應(yīng)面圖??Ｆｉｇ．２－５?Ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｖａｒｉｏｕｓ?ｆａｃｔｏｒｓ?ａｎｄ?ｔｈｅｉｒ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｙｉｅｌｄ?（Ａｉ－Ａｓ）．??ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｒａｔｅ?（Ｂ１－Ｂ３），?ａｖａｉｌａｂｌｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?

量濃度為??３０．３０?ｇ／Ｌ的崩潰酶＋１０?ｇ／Ｌ溶壁酶的混合酶液中酶解２．５?ｈ。在此條件下進(jìn)行５次試驗(yàn)，結(jié)果顯??示優(yōu)化后ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生質(zhì)體平均產(chǎn)量可以達(dá)到７．１２Ｘ?１〇７個(gè)／ｍＬ，與預(yù)測(cè)值６．８１?Ｘ?１〇７個(gè)／ｍＬ??相差４．５６％；再生率平均為５．５６％，與預(yù)測(cè)值５．６７％相差１．９８％；有效原生質(zhì)體量平均為??３９．５９Ｘ?１０５個(gè)／ｍＬ，與預(yù)測(cè)值３８．５３Ｘ１０５個(gè)／ｍＬ相差２．７５％。證明該模型是可靠的。優(yōu)化后產(chǎn)生??的原生質(zhì)體大小均勻，球體圓潤(rùn)，菌絲很少（圖２－６），可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。??１＿?＿??圖２－６?ＮＱ８ＧＩＩ４菌絲和原生質(zhì)體??Ｆｉｇ．２－６?Ｈｙｐｈａｅ?ａｎｄ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｏｆ?ＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ??注：Ａ：萌發(fā)１６ｈ的枸杞內(nèi)生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４蘭株菌絲體；Ｂ：枸杞內(nèi)生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生質(zhì)體；Ｃ：枸杞內(nèi)生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌??株原生質(zhì)體再生．標(biāo)尺＝５０?ｐｍ．??Ｎｏｔｅ：?Ａ：?Ｇｅｎｎｉｎａｔｅｄ?ｃｏｎｉｄｉａ?ｏｆＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ?ｆｏｒ?１６?ｌｉ；?Ｂ：?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｏｆＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ；?Ｃ：?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｒｅｇｅｎｅｒａｌｉｏｎ?ｏｆＮＱ８ＧＵ４??ｓｔｒａｉｎ．?Ｂａｒｓ＝５０｜．ｉｍ．??２．４討論??原生質(zhì)體制備與再生是兩個(gè)相互聯(lián)系的過(guò)程，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率是評(píng)價(jià)原生質(zhì)體制??備質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)［ＳＱ］。獲得一定濃度、純度和活力的原生質(zhì)體是進(jìn)行分子遺傳學(xué)操作的基礎(chǔ)和??前提保障之一［ｍ］。關(guān)于絲狀真菌原生質(zhì)體制備國(guó)內(nèi)外己有不少的研宄報(bào)道，但是由于細(xì)胞壁結(jié)??構(gòu)較為

寧夏大學(xué)碩士學(xué)位論文?第三章枸杞拮抗內(nèi)生真菌ＮＱ８Ｇ１１４菌株ＧＦＰ標(biāo)簽蛋白表達(dá)載體的篩選??圖３－３?４種轉(zhuǎn)化子菌落特征??Ｆｉｇ．３－３?Ｔｈｅ?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ?ｏｆ?４?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ??Ａ：表達(dá)載體ｐＦＬ２擬轉(zhuǎn)化子；Ｂ：表達(dá)載體ｐＤＬ２擬轉(zhuǎn)化子；Ｃ：表達(dá)載體ｒ－ＫＮＴ擬轉(zhuǎn)化子；Ｄ：表達(dá)載體ＫＮＴＧ擬轉(zhuǎn)化子．??Ａ：?ｐＦＬ２?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；?Ｂ：?ｐＤＬ２?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ：?Ｃ：?ｒ－ＫＮＴ?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；?Ｃ：?ＫＮＴＧ?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．??３．３．３?ＮＱ８ＧＩＩ４菌株轉(zhuǎn)化子的ＰＣＲ檢測(cè)??隨機(jī)挑取在３０?ｍｇ／Ｌ?ＨｍＢ或１００?ｍｇ／Ｌ?Ｇ４］?８上生長(zhǎng)良好的菌落，分別提取菌絲體ＤＮＡ進(jìn)行??ＰＣＲ擴(kuò)増，ｐＦＬ２?（圖３４?Ａ）和ｐＤＬ２?（圖３４?Ｂ）轉(zhuǎn)化子均可以擴(kuò)增出５００ｂｐ左右的目的條帶，??ｒ－ＫＮＴ?（圖３－４?Ｃ）和ＫＮＴＧ轉(zhuǎn)化子（圖３－４?Ｄ）均可以擴(kuò)増出７００?ｂｐ左右的目的條帶，與表達(dá)??載體擴(kuò)增出的條帶相同，而野生型ＮＱ８Ｇ１Ｉ４菌株均未擴(kuò)增出目的條帶。說(shuō)明ｇ辦基因已經(jīng)被成??功整合到了?ＮＱ８ＧＩＩ４菌株基因組中。??ＰＭ?Ｉ?２?３?４?５?６?ＷＴ?Ｍｌ?２?３４５?６?７８?９１０Ｉ１Ｉ２ＰＷＴ??ｉ〇〇ｂｐ??Ｍｌ?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?Ｊ５?Ｐ?ＷＴ??５〇０ｂｐ?７００ｂｐ??２５０ｂｐ??１〇ｕｂｐ?：胃??Ｍ?＼?２?３?４?５?６?７?８

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[5]鉤狀木霉的綠色熒光蛋白標(biāo)記體系構(gòu)建及其對(duì)辣椒的促生和疫霉病害的生防作用[D]. 趙興麗.貴州師范大學(xué) 2017
[6]核桃高活性內(nèi)生真菌篩選及其代謝產(chǎn)物抑菌活性的研究[D]. 劉澤星.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2017
[7]堿蓬內(nèi)生真菌JP4-1的篩選、鑒定及促生活性研究[D]. 于飛.沈陽(yáng)師范大學(xué) 2016
[8]PEG介導(dǎo)的蘋(píng)果果生刺盤(pán)孢Colletotrichum fructicola原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的研究[D]. 韓小路.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[9]4株生防菌對(duì)番茄灰霉病的防治及改良菌株F1-35的GFP標(biāo)記研究[D]. 甘良.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
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