由專性活體營養(yǎng)寄生菌條形柄銹菌小麥�；停≒uccinia striiformis f.sp.tritici）引起的小麥條銹病嚴(yán)重威脅及危害著小麥的安全生產(chǎn)。然而,由于病原菌的毒性頻率變化之快以及毒性變異方式的多元化,使得目前生產(chǎn)上使用的小麥抗性品種存在抗病性逐漸減弱甚至喪失等問題。條銹菌可以通過吸器分泌一些毒性因子,特別是一些參與致病相關(guān)進(jìn)程的效應(yīng)蛋白,從而影響小麥產(chǎn)量。鑒于此,對于此類效應(yīng)蛋白相關(guān)功能的探究與剖析,將有助于我們準(zhǔn)確把握條銹菌致病機(jī)理,對于以后開展條銹病的防控具有重要的理論指導(dǎo)意義。在前期研究中,我們借助于生物信息學(xué)的相關(guān)分析手段,以及結(jié)合酵母分泌系統(tǒng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)和病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）篩選到了一個條銹菌典型的效應(yīng)蛋白Pst06941。在此基礎(chǔ)上,利用酵母篩庫獲得了幾個其在寄主中的潛在候選靶標(biāo)蛋白,運(yùn)用酵母雙雜交、BIFC及pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中一個是效應(yīng)蛋白Pst06941在小麥中的靶標(biāo),即小麥的NADH脫氫酶亞基I（TaNADH Ⅰ）。在植物體中,NADH脫氫酶通常是以一種復(fù)合體的方式普遍存在,而I型的NADH脫氫酶則是在電子傳遞的過... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

TaNADHI與Pst06941酵母雙雜交驗(yàn)證

第二章 小麥條銹菌效應(yīng)蛋白 Pst06941 靶標(biāo)的篩選及驗(yàn)證2.4.2.2 雙分子熒光互作驗(yàn)證通過酵母雙雜交的技術(shù)手段已經(jīng)證明 TaNADH I 與 Pst06941 存在互作關(guān)系接著借助煙草過表達(dá)系統(tǒng)對這兩者的互作關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。將基因Pst06941 構(gòu)建到載體 SPYCE 上，將 TaNADH I 基因構(gòu)建到載體 SPYNE 上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、搖菌、濃度稀釋等步驟后，將菌液進(jìn)行均等量的混合并共同注射到適宜的煙草葉片上，2 天左右在顯微鏡下進(jìn)行表達(dá)情況的鏡檢觀察，并選取清晰的視野進(jìn)行拍照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別帶有黃色熒光標(biāo)簽 YFP 的 C 末端和 N 末端的 Pst0694和 TaNADH I 能夠發(fā)生相互融合，讓 YFP 得以正常的表達(dá)，且能在顯微鏡下被清晰的捕捉到，從而進(jìn)一步證明 Pst06941 和 TaNADH I 存在互作關(guān)系（圖 2-2）

西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文照 GST 空載體也進(jìn)行體外蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。之后利用 Thermos 公司的 GST-Pulldown 試劑盒進(jìn)行蛋白的互作驗(yàn)證。在此過程中，先將陰性對照 GST 蛋白和GST-TaNADH I 分別結(jié)合在含有 GST 填料的柱子，之后再將攜帶有 His 標(biāo)簽的Pst06941 可溶性蛋白分別添加在上述兩個柱子中，共同孵育，蛋白得到成功的洗脫且收集后進(jìn)行 Western 印跡分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對照 GST、GST-TaNADH I 和 His-Pst06941 蛋白在體外均得到了有效表達(dá)，在 Western 印記分析中兩個標(biāo)簽均能夠與相應(yīng)抗體結(jié)合并被顯色；在試驗(yàn)組中，陰性對照 GST 與 His-Pst06941 這一組合僅雜到了 GST 對照蛋白，而 GST-TaNADH I 和 His-Pst06941 這一組合中 GST 與 His 標(biāo)簽均能夠被印跡和顯色，充分表明這兩者存在互作關(guān)系（圖 2-3）。

【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]Ⅱ型NADH脫氫酶NDH2的結(jié)構(gòu)與功能研究[D]. 李文斐.清華大學(xué) 2015
[2]擬南芥線粒體中交替型NAD（P）H脫氫酶活性復(fù)合體的蛋白質(zhì)相互作用研究[D]. 徐曉麗.蘭州大學(xué) 2010

碩士論文
[1]楊樹葉綠體NADH脫氫酶基因的克隆與序列分析[D]. 楊建國.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：3266988