發(fā)布時間：2021-06-22 21:40

　　野生型酵母菌株34-9,屬于檸檬型克勒克酵母（Kloeckera apiculata）,具有抑制柑橘采后青綠霉病的生物防治作用,由于該菌易受環(huán)境影響,并且防治的病原菌種類單一,所以存在防治效果不穩(wěn)定,抑菌譜較窄等問題。酵母菌株34-9的防治效果,可以通過對其基因進(jìn)行改良的方式來優(yōu)化,以實(shí)現(xiàn)在分子水平上對酵母的轉(zhuǎn)化。本課題實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo),通過優(yōu)化酵母的轉(zhuǎn)化體系條件,包括預(yù)培養(yǎng)階段是否加入乙酰丁香酮,酵母的濃度,共培養(yǎng)階段的時間和溫度,以及承載膜的類型,得到了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子,建立了酵母菌株34-9的遺傳突變體庫。同時,對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了生防效力的初步探究,研究了轉(zhuǎn)化子對柑橘采后酸腐病和炭疽病的防治效果。研究的主要結(jié)果如下:1.優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的條件:供體農(nóng)桿菌AGL-1的OD₆₀₀為0.6,酵母34-9的菌液濃度為8×10⁷CFU/mL時,預(yù)培養(yǎng)階段加入乙酰丁香酮,共培養(yǎng)階段用濾紙作為承載膜,溫度調(diào)至28℃,培養(yǎng)48h,達(dá)到的轉(zhuǎn)化效率最高。2.通過對500個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生防效力檢測,找到一株可以延緩酸腐菌AY-1發(fā)病的酵母轉(zhuǎn)化子... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

pTFCM-G418載體結(jié)構(gòu)圖

圖 3-1 野生酵母 34-9 對潮霉素 B 的敏感性分析Fig.3-1 Assessment of sensitivity of 34-9 to hygromycin B在用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化生防酵母 34-9 之前，需要確定轉(zhuǎn)化所用的。通過涂皿法，來確定 34-9 對潮霉素 B 的敏感程度。對于生防酵母 3了 6 種不同的潮霉素 B 濃度（0，50，100，200，300，400ug/mL），以素 B 的培養(yǎng)基為對照。圖 3-1 為觀察 7d 后的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在 為 50ug/mL－300ug/mL 的濃度下，酵母 34-9 在平板上都有不同程度的潮霉素濃度的增大，酵母 34-9 的生長越來越受抑制，在 300ug/mL 時僅母單菌落生長。通過 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在含 400ug/mL 潮霉素 B 培養(yǎng)基觀 一直沒有生長，最終確定了酵母 34-9 對潮霉素 B 的臨界敏感濃ug/mL。

圖 3-2 野生酵母 34-9 對 G418 的敏感性分析Fig.3-2 Assessment of sensitivity of 34-9 to G418采用涂皿法確定酵母 34-9對G418的敏感程度。設(shè)置了5種含不同濃度G418的培養(yǎng)基，G418 的濃度分別是 0，10，20，30，40ug/mL，以不含 G418 的培養(yǎng)基為對照，觀察酵母 34-9 在培養(yǎng)基上的生長情況。圖 3-2 為觀察 7d 后的結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)的前 2 天，酵母 34-9 就已經(jīng)在含 0，10，20ug/mLG418 的培養(yǎng)基上生長，在含 30，40ug/mLG418 的培養(yǎng)基上不生長，此后繼續(xù)觀察，在第 5 天時，發(fā)現(xiàn)在含 30ug/mLG418 的培養(yǎng)基上零星的長出了酵母單菌落，而在含 40ug/mLG418培養(yǎng)基上，酵母 34-9 一直沒有生長，直到一周之后，酵母 34-9 仍未在含40ug/mLG418 的培養(yǎng)基上生長，重復(fù) 3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，確定酵母 34-9 對 G418的臨界敏感濃度為 40ug/mL。綜上，當(dāng)潮霉素 B 濃度為 400ug/mL 時，酵母 34-9 不再生長；當(dāng) G418 濃度為 40ug/mL 時，酵母 34-9 的生長被完全抑制，由此可見，同潮霉素 B 相比，酵母 34-9 對 G418 更敏感。所以最終選擇 G418 為酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的篩選標(biāo)記。在轉(zhuǎn)

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號：3243578