大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性病原細(xì)菌如炭疽芽胞桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等都存在dlt操縱子,其功能是使細(xì)胞壁的磷壁酸發(fā)生D-丙氨�；揎�,從而使細(xì)胞壁表面帶正電荷,導(dǎo)致對(duì)宿主陽(yáng)離子抗菌肽（AMPs）的抵抗力增強(qiáng),逃避宿主免疫反應(yīng),這是病原微生物在與宿主相互作用過(guò)程中進(jìn)化出的一種有效保護(hù)機(jī)制。蘇云金芽胞桿菌（簡(jiǎn)稱Bt）是昆蟲及線蟲的一種革蘭氏陽(yáng)性病原細(xì)菌,分析其基因組發(fā)現(xiàn)也有dlt操縱子的存在。Bt作為一種殺蟲微生物,以殺蟲晶體蛋白為其主要?dú)⑾x活性成分,在其與昆蟲宿主相互作用過(guò)程中,病原和宿主都會(huì)進(jìn)化出各種保護(hù)機(jī)制,從而提高其在自然界中的生存能力,dlt操縱子極有可能是Bt逃避昆蟲宿主免疫反應(yīng)的一種有效方式。因此,本研究通過(guò)敲除Bt菌株中dlt操縱子,分析其對(duì)Bt自身生長(zhǎng)繁殖等基礎(chǔ)生物學(xué)方面的影響,并探討其在與昆蟲宿主相互作用過(guò)程中的生物學(xué)功能。本研究利用同源重組技術(shù)敲除Bt無(wú)晶體突變株BMB171中dltA基因,成功構(gòu)建了dltA基因缺失突變株,同時(shí)構(gòu)建了互補(bǔ)株和空載體菌株。表面電荷差異分析表明dl 操縱子功能缺失可引起菌體細(xì)胞表面凈負(fù)電荷顯著增加,驗(yàn)證了其在Bt中具... 

【文章來(lái)源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?Ｃｒｙ毒素的孔洞形成模型［４６］??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐｏｒｅ?ｆｏｒｍａｔｉｏｎ?ｍｏｄｅｌ?ｏｆ?Ｃｒｙ?ｔｏｘｉｎｓ１４６＾??

導(dǎo)致害蟲對(duì)其抗性形成。目前，己有大量研宂表明Ｃｒｙ毒素蛋白能與多種膜蛋白??結(jié)合，包括堿性磷酸酶［５Ｑ］、氨肽酶祕(mì)４５］、鈣黏蛋白［５１－５３］和人８＜：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［５４］等，??圖１－３中展示了毒素ＣｒｙｌＡｂ在煙草天蛾（Ｍｓｅｘｒａ）上的三個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)［５５］。??ｇｉＦ?—：「巧……．．：：ｒ??ＡＬＰ?ＡＰＮ??Ｃａｄｆａｅｒｉｎ??圖１－３?ＣｒｙｌＡｂ毒素單體／低聚物與煙草天蛾上三個(gè)受體的結(jié)合位點(diǎn)［５５１??Ｆｉｇ．?１－３?Ｂｉｎｄｉｎｇ?ｒｅｇｉｏｎｓ?ｏｆ?ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ／ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ?ｆｏｒｍｓ?ｍａｐｐｅｄ?ｉｎ?Ｃｒｙｌ?Ａｂ?ｔｏｘｉｎ?ｔｏ?Ｍａｎｄｕｃａ??ｓｅｘｔａ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，?ｃａｄｈｅｒｉｎ，?ＡＬＰ?ａｎｄ?ＡＰＮ＾５５＾??但是Ｃｙｔ殺蟲蛋白到目前為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與之特異性相結(jié)合的膜受體，關(guān)于??其作用機(jī)理己有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表明，Ｃｙｔ分子是不能直接與膜結(jié)合的，只有當(dāng)其??被激活后先和位于膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生親和，再通過(guò)多個(gè)Ｃｙｔ分子寡聚化進(jìn)??一步產(chǎn)生Ｐ－桶狀跨膜結(jié)構(gòu)，最終在細(xì)胞膜上形成孔隙，水和離子由孔大量進(jìn)入細(xì)??胞質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解以及組織損傷??２．２營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白??營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白（ＶＩＰｓ）是Ｂｔ菌體在營(yíng)養(yǎng)期這一生長(zhǎng)階段內(nèi)形成的一類對(duì)??昆蟲有高效毒殺活性的新型蛋白，達(dá)到了納克級(jí)水平，它與ＩＣＰ在進(jìn)化上沒(méi)有同??７??

�。拢艋蚪M作為模板，用引物對(duì)（ｉ／ｄｕｐ－Ｆ、ｃｆｅ４－ｕｐ－Ｒ和ｄ／Ｍ－ｄｏｗｎ－Ｆ、??』Ｌ４－ｄｏｗｎ－Ｒ擴(kuò)增基因的上下游同源臂，得到５７７ｂｐ的上游臂和５７１ｂｐ的下??游同源臂（圖３－１），膠回收片段后經(jīng)雙酶切、分步連接到ｐＲｅｃ－ｍｏｂ－Ｔｓ載體上，??構(gòu)建流程如圖３－２所示，熱轉(zhuǎn)至Ｚｃｏ／ｉ?ＤＨ５ｏｔ中，重組子￡．ｃｏ／ｚ＿?ＤＨ５ａ??（ｐＲｅｃ－ｍｏｂ－Ｔｓ－ｕｐ－ｄｏｗｎ）分別經(jīng)?＿ＳａｗＨ?Ｉ、ｆｅｅ?Ｉ?和Ｉ、＆／１?雙酶切鑒定（圖?３－３?），??獲得正確轉(zhuǎn)化子。??ｂｐ??腿—??７５０?—??５００?—??２５０??圖３－１?ｒｆ／ｄ基因上／下游同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物分析??Ｆｉｇ．３－１?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｏｒ?ｄｌｔＡ?ｇｅｎｅ?ｕｐｓｔｒｅａｍ?／ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ??ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ??１?ｊ／Ｍ基因上游同源臂??２：?Ｊ／Ｍ基因下游同源臂??３５??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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