枯草芽孢桿菌（Bacillus subiilis）是一種典型的革蘭氏陽性菌,能夠分泌纖維素酶提高大熊貓對竹子中纖維素的消化率,還能夠通過產(chǎn)生抗菌肽以及營造腸道厭氧環(huán)境來維持腸道菌群平衡,保持大熊貓腸道健康,是目前制備大熊貓益生菌添加劑的侯選菌株之一。成年大熊貓以竹子為主食,其腸道內(nèi)部是一個典型的高纖維環(huán)境。高纖維環(huán)境對于枯草芽孢桿菌而言是一種壓力脅迫環(huán)境,適應(yīng)大熊貓腸道高纖維環(huán)境是枯草芽孢桿菌發(fā)揮各種益生功能的前提,因此本研究希望找到影響枯草芽孢桿菌高纖維環(huán)境適應(yīng)能力的關(guān)鍵因素,為之后利用基因工程技術(shù)改造枯草芽孢桿菌,得到對高纖維環(huán)境適應(yīng)能力更強,能夠更好發(fā)揮益生作用的菌株提供指導(dǎo)。Hfq（a host factor for RNA phage Qβ）蛋白是一種廣泛存在于細菌細胞內(nèi)的調(diào)控蛋白,作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子,對細菌包括適應(yīng)壓力環(huán)境在內(nèi)的多項生命活動都起到了重要的調(diào)控作用。但是Hfq蛋白在枯草芽孢桿菌適應(yīng)大熊貓腸道高纖維環(huán)境的過程是否起到調(diào)控作用尚不清楚,為了研究Hfq蛋白在枯草芽孢桿菌適應(yīng)大熊貓腸道高纖維環(huán)境的過程中是否具有調(diào)控作用,本研究對實驗室保存的大熊貓源枯草芽孢桿菌B... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１敲除載體ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ構(gòu)建流程圖??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ??

向６０?ｊａＬ?ＨＨ２感受態(tài)細胞中加入５０?ｎｇ敲除載體ｐＭＵＴｉｎ４－ｈｆｑ?（１－８?ｐＬ），??冰�。�?ｍｉｎ后將菌液加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中（１?ｍｍ），電擊一次，電轉(zhuǎn)條件為１９００ｖ，??１ｍｍ。（電擊結(jié)果：時間常數(shù)＝４．５－５．０?ｍｓ，如果時間常數(shù)小于４．２?ｍｓ，則需要增??加電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基的漂洗次數(shù)或者提高感受態(tài)的稀釋倍數(shù)來獲得更高的轉(zhuǎn)化率）。電??擊完畢后取出電轉(zhuǎn)杯并立即加入１?ｍＬ?３７?°Ｃ預(yù)熱培養(yǎng)基ＲＭ，３７?°Ｃ，?２００?ｒ／ｍｉｎ??復(fù)蘇培養(yǎng)３?ｈ后，�。担�?ｕＬ菌液涂布ＬＢ－Ｅｍ?（０．５?噸／ｍＬ）平板，３７?°Ｃ，倒置培??養(yǎng)２４?ｈ。挑取單菌落在ＬＢ－Ｅｍ液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，取菌液進行ＰＣＲ鑒定。??ｈｆｑ基因缺失株構(gòu)建結(jié)構(gòu)示意圖如圖２－２所示，針對缺失株的基因序列設(shè)計兩對??特異性鑒定引物?ｈｆｑ－Ｆｌ、ｌａｃＺ－Ｒ?和?Ｐａｐａｃ－Ｆ、ｈｆｑ－Ｒｌ：ｈｆｑ－Ｆｌ、ｌａｃＺ－Ｒ?用于擴增用??于擴增ｈｆｑ基因同源序列上游和插入失活載體ｌａｃＺ基因位點的序列，ｈｆｑ－Ｒｌ，??Ｐａｐａｃ－Ｆ用于擴增ｈｆｑ基因同源序列下游和插入失活載體Ｐｓｐａｃ基因位點的序列，??引物序列見本章表２－４，?ＰＣＲ反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同本章２．３，將ＰＣＲ鑒定結(jié)果??正確的菌株送到擎科生物公司測序。??Ｐｓｐａｃ??

提取??的ＤＮＡ通過１?％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳結(jié)果如圖２－３所示，顯示基因??組ＤＮＡ提取效果較好，沒有蛋白、酚等雜質(zhì)的污染。??Ｍ?１?２?３?４?５?Ｍ??ｆＭｓ－，?＾?？??２０００?—??＇、、心＇，，??１０００?—??：？〇－??５００?—??…’?、、’??圖２－３?ＨＨ２基因組ＤＮＡ屯泳結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－５：?ＨＨ２?ＤＮＡ?條帶??Ｆｉｇ．?２－３?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｒｅｓｕＬｔｓ?ｏｆ?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－５：?ＨＨ２?ｇｅｎｏｍｅ?ＤＮＡ??３．２?ｈｆｑ基因同源序列ＰＣＲ擴增與回收純化??以ｈｆｑ－Ｆ和ｈｆｑ－Ｒ為引物，５．仰汾／ｔｏ?ＨＨ２基因組ＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴增ｈｆｑ??基因同源片段，擴增產(chǎn)物電泳通過１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖２－４，在??１７０?ｂｐ左右出現(xiàn)特異性條帶

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]細菌Hfq蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及作用機制[J]. 樊奔,陳晟,李昱龍.  南京林業(yè)大學學報(自然科學版). 2016(05)
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[6]ncRNA伴侶分子hfq基因缺失對單核細胞增生李斯特菌環(huán)境適應(yīng)能力的影響[J]. 盧海亭,喬軍,孟慶玲,彭葉龍,陳誠,劉田莉,謝堃,才學鵬,陳創(chuàng)夫.  應(yīng)用與環(huán)境生物學報. 2015(06)
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碩士論文
[1]變形鏈球菌耐氟菌株及其親代菌株ciaH、clpP基因的表達差異分析[D]. 李朋蓮.吉林大學 2015
[2]竹子纖維素及其衍生的納米材料[D]. 張鵬鵬.浙江工業(yè)大學 2014



本文編號：3232585