發(fā)布時(shí)間：2021-05-18 12:09

　　由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中的毀滅性病害。培育抗晚疫病品種成為馬鈴薯育種的主要目標(biāo)之一。致病疫霉是目前已知基因組最大的卵菌,編碼超過(guò)500個(gè)RXLR類(lèi)效應(yīng)分子,它們通過(guò)抑制寄主的多重防衛(wèi)反應(yīng),或劫持植物感病因子,為入侵和增殖創(chuàng)造合適的環(huán)境。本研究針對(duì)RXLR效應(yīng)分子在非寄主植物龍葵上的識(shí)別和馬鈴薯抗病基因的體外修飾,開(kāi)展了兩部分工作,取得以下研究結(jié)果:1.以晚疫病菌A1融合群黑龍江分離菌株（HLJ）為模板,合作構(gòu)建包含251個(gè)RXLR效應(yīng)分子的基因庫(kù)。通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),篩選到三個(gè)特異性引起龍葵（SN022）過(guò)敏性壞死反應(yīng)（HR）的候選無(wú)毒基因并開(kāi)展了功能研究:（1）PITG₁6245.2。PITG₁6245.2在致病疫霉侵染馬鈴薯活體營(yíng)養(yǎng)階段被顯著上調(diào)表達(dá),在馬鈴薯和本氏煙中超量表達(dá)該基因能夠下調(diào)寄主的防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá),影響寄主的正常生長(zhǎng)并促進(jìn)感病;PITG₁6245.2在11個(gè)致病疫霉菌株中均有同源序列,其中6個(gè)同源序列喪失在SN022上激發(fā)HR能力,結(jié)合基因定點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn),其第53、66、70和78... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：119 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
符號(hào)說(shuō)明
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 馬鈴薯晚疫病
        1.1.1 馬鈴薯
        1.1.2 馬鈴薯晚疫病
    1.2 致病疫霉
        1.2.1 致病疫霉的效應(yīng)分子
        1.2.2 致病疫霉的RXLR效應(yīng)分子
        1.2.3 RXLR效應(yīng)分子的功能
            1.2.3.1 抑制植物PTI
            1.2.3.2 激起植物ETI
            1.2.3.3 逃脫植物抗病基因監(jiān)測(cè)
            1.2.3.4 抑制植物ETI
        1.2.4 RXLR效應(yīng)分子進(jìn)入寄主的機(jī)理
        1.2.5 RXLR效應(yīng)分子抑制植物免疫反應(yīng)的機(jī)理
            1.2.5.1 穩(wěn)定植物免疫的負(fù)調(diào)控因子促進(jìn)致病疫霉的侵染
            1.2.5.2 干擾植物免疫的正向調(diào)控因子促進(jìn)致病疫霉的侵染
            1.2.5.3 改變自身或互作蛋白的定位促進(jìn)致病疫霉的侵染
            1.2.5.4 影響寄主免疫的其他路徑
    1.3 植物抗病性
        1.3.1 寄主抗性
        1.3.2 抗病基因概況
        1.3.3 非寄主抗性
            1.3.3.1 預(yù)存性/組成性抗性
            1.3.3.2 誘導(dǎo)抗性
        1.3.4 非寄主抗性基因的克隆應(yīng)用
        1.3.5 致病疫霉的非寄主抗性研究進(jìn)展
        1.3.6 馬鈴薯晚疫病的非寄主—龍葵
    1.4 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和載體
        2.1.2 供試植物
        2.1.3 馬鈴薯晚疫病菌
        2.1.4 常用緩沖液及培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 常用化學(xué)試劑、分子生物學(xué)試劑及儀器
    2.2 方法
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 載體構(gòu)建
            2.2.2.1 DNA提取
            2.2.2.2 RNA提取
            2.2.2.3 cDNA的獲取
            2.2.2.4 目的片段的獲取
            2.2.2.5 酶切載體的構(gòu)建
            2.2.2.6 gateway方法載體的構(gòu)建
            2.2.2.7 In-fusion方法載體的構(gòu)建
        2.2.3 RXLR類(lèi)效應(yīng)分子瞬時(shí)表達(dá)基因庫(kù)的構(gòu)建
        2.2.4 基因定點(diǎn)突變分析
        2.2.5 基因的瞬時(shí)表達(dá)
        2.2.6 晚疫病的葉片離體接種法
            2.2.6.1 致病疫霉的培養(yǎng)及游動(dòng)孢子的獲得
            2.2.6.2 葉片離體接種
        2.2.7 熒光定量檢測(cè)
            2.2.7.1 基因表達(dá)量的檢測(cè)
            2.2.7.2 菌絲生長(zhǎng)量的檢測(cè)
        2.2.8 本氏煙的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.9 馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.10 無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的誘導(dǎo)獲得
        2.2.11 酵母cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及篩選
            2.2.11.1 酵母cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
            2.2.11.2 酵母cDNA文庫(kù)的篩選
        2.2.12 蛋白互作鑒定
            2.2.12.1 酵母雙雜交檢測(cè)蛋白互作
            2.2.12.2 免疫共沉淀檢測(cè)蛋白互作
                2.2.12.2.1 免疫印跡雜交
                2.2.12.2.2 免疫共沉淀
            2.2.12.3 熒光雙分子互補(bǔ)檢測(cè)蛋白互作
        2.2.13 病毒介導(dǎo)的基因沉默
        2.2.14 蛋白的原核表達(dá)
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 候選效應(yīng)分子的篩選
        3.1.1 RXLR效應(yīng)分子瞬時(shí)表達(dá)基因庫(kù)的構(gòu)建
        3.1.2 龍葵特異性識(shí)別的候選無(wú)毒基因的篩選
    3.2 候選無(wú)毒基因的功能分析
        3.2.1 候選無(wú)毒基因PITG_16245.2的功能分析
            3.2.1.1 PITG_16245.2HLJ在致病疫霉侵染龍葵過(guò)程中被上調(diào)表達(dá)
            3.2.1.2 PITG_16245.2存在序列多態(tài)性,存在可以逃脫龍葵檢測(cè)的同源序列
            3.2.1.3 PITG_16245.2第53,66,70和78位氨基酸是龍葵識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)
            3.2.1.4 PITG_16245.2HLJ在致病疫侵染階段被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)
            3.2.1.5 PITG_16245.2HLJ促進(jìn)致病疫霉在本氏煙定殖
            3.2.1.6 PITG_16245.2HLJ促進(jìn)致病疫霉在馬鈴薯上定殖
            3.2.1.7 逃脫龍葵檢測(cè)的PITG_16245.23928A并不影響其促進(jìn)侵染的功能
            3.2.1.8 PITG_16245.2HLJ能夠與PR4b互作
            3.2.1.9 PR4b在致病疫霉侵染階段被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)并能抑制致病疫霉的定殖
            3.2.1.10 PITG_16245.2HLJ通過(guò)改變St PR4b的亞細(xì)胞定位促進(jìn)致病疫霉的侵染
            3.2.1.11 SnPR4b是龍葵識(shí)別PITG_16245.2HLJ的關(guān)鍵基因
        3.2.2 候選無(wú)毒基因PITG_20301.2的功能驗(yàn)證
            3.2.2.1 PITG_20301.2的序列分析
            3.2.2.2 PITG_20301.2第43位氨基酸是龍葵識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)
            3.2.2.3 PITG_20301.2HLJ能夠促進(jìn)致病疫霉在本氏煙的定殖
            3.2.2.4 PITG_20301.2HLJ能夠促進(jìn)致病疫霉在馬鈴薯的定殖
            3.2.2.5 PITG_20301.2HLJ能夠抑制INF1,NIP,Avh238和Avh241引起的細(xì)胞死亡
        3.2.3 候選無(wú)毒基因PITG_04194.1的功能驗(yàn)證
            3.2.3.1 PITG_04194.1的序列分析
            3.2.3.2 PITG_04194.1HLJ能夠促進(jìn)致病疫霉在寄主上的定殖
            3.2.3.3 PITG_04194.1HLJ能夠抑制抗病相關(guān)基因的表達(dá)
            3.2.3.4 PITG_04194.1HLJ能夠抑制BAX,INF1,NIP,Avh238和Avh241在本氏煙上引起的HR
    3.3 非寄主識(shí)別候選效應(yīng)分子的機(jī)理
        3.3.1 不同龍葵品種識(shí)別候選效應(yīng)分子不同
        3.3.2 龍葵中SnPR4b能夠直接識(shí)別三個(gè)候選無(wú)毒基因
        3.3.3 沉默SnPR4b能夠影響龍葵對(duì)三個(gè)候選效應(yīng)分子的識(shí)別
        3.3.4 SnPR4b能與SnLRR1互作
        3.3.5 SnLRR1僅能夠影響龍葵對(duì)PITG_16245.2HLJ的識(shí)別
        3.3.6 非寄主識(shí)別候選無(wú)毒基因的機(jī)理
    3.4 啟動(dòng)子置換創(chuàng)制新的馬鈴薯抗晚疫病基因Rpi-OM1.2
        3.4.1 新的馬鈴薯抗晚疫病基因Rpi-OM1.2的創(chuàng)制策略
        3.4.2 Rpi-OM1.2能夠提高馬鈴薯對(duì)致病疫霉的抗性
        3.4.3 無(wú)選擇標(biāo)記的Rpi-OM1.2株系的獲得
        3.4.4 無(wú)選擇標(biāo)記的Rpi-OM1.2株系的抗性檢測(cè)
        3.4.5 Rpi-OM1.2識(shí)別的候選無(wú)毒基因篩選
4 討論
    4.1 PITG_16245.2具有多重功能
    4.2 候選無(wú)毒基因PITG_20301.2HLJ和PITG_04194.1HLJ的功能研究
    4.3 龍葵識(shí)別候選無(wú)毒基因的機(jī)理
    4.4 啟動(dòng)子置換能夠創(chuàng)制新的無(wú)不良影響高抗晚疫病抗病基因
5 結(jié)論
6 參考文獻(xiàn)
7 附錄
    7.1 常用緩沖液及培養(yǎng)基的配制
        7.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)基
        7.1.2 質(zhì)粒抽提液
        7.1.3 植物遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基以及常用貯液配方
    7.2 常用化學(xué)試劑、分子生物學(xué)試劑
        7.2.1 常用化學(xué)試劑
        7.2.2 分子生物學(xué)試劑
    7.3 本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列表
8 致謝
9 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]中國(guó)馬鈴薯晚疫病菌交配型研究進(jìn)展[J]. 王騰,孫繼英,汝甲榮,王立春.  中國(guó)馬鈴薯. 2018(01)
[2]RXLR類(lèi)效應(yīng)分子PITG21645.2的基因序列分析及功能驗(yàn)證[J]. 李金徽,王嬌,高存鋼,王博,張瑾瑾,尹軍良,丁新華,儲(chǔ)昭輝.  植物病理學(xué)報(bào). 2018(01)
[3]龍葵抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 安磊,唐勁天,劉新民,高南南.  中國(guó)中藥雜志. 2006(15)
[4]微波輔助提取龍葵中總生物堿的研究[J]. 劉覃,陳曉青,蔣新宇,吳升德.  天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā). 2005(01)
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[7]中國(guó)龍葵復(fù)合種細(xì)胞學(xué)分析和地理分布的研究[J]. 楊永年,張海洋,吳國(guó)宜.  植物研究. 1994(02)

博士論文
[1]大豆疫霉中CRN效應(yīng)分子在本氏煙中的功能分析[D]. Nasir Ahmed Rajput.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[2]非寄主抗性基因介導(dǎo)水稻抗細(xì)菌性條斑病的分子機(jī)理及水稻抗白葉枯病材料的篩選和QTL定位[D]. 許美容.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011

碩士論文
[1]品種多樣性對(duì)馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響[D]. 覃雁瑜.福建農(nóng)林大學(xué) 2014
[2]馬鈴薯晚疫病抗病基因的分子改造和水稻白葉枯病菌IAA合成途徑相關(guān)基因鑒定[D]. 李海萍.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3193763