蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)是原核和真核細胞中廣泛存在的一種蛋白降解機制,對于維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)細胞對于環(huán)境條件改變尤其是逆境脅迫適應發(fā)揮作用。蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）0-9是前期研究中從小麥根系分離得到的一株內(nèi)生細菌,能產(chǎn)生芽孢和生物薄膜,具有較強的運動能力,能夠在小麥內(nèi)部穩(wěn)定生存,對于包括小麥紋枯病和小麥根腐病等多種植物土傳病害具有生防能力。生防細菌對于環(huán)境的高度適應是其發(fā)揮作用的前提。目前,有關(guān)B.cereus中是否存在蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)尚未見報道。研究召.cereus的蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)有助于揭示回答細菌的環(huán)境適應機制,對于開發(fā)植物病害生防制劑奠定基礎。本研究利用基因序列分析軟件分析B.cereus 0-9基因組序列,分析出與依賴Clpx/Hspl00蛋白家族相關(guān)功能性基因共11基因。通過進行引物設計,構(gòu)建敲除載體,完成敲除載體的遺傳轉(zhuǎn)化,最終成功構(gòu)建11個基因缺失菌株。分別是0-9（△clpB）、0-9（△clpC）、0-9（AclpPl）、0-9（△clpP2）、0-9（△ftsH）、0-9（△clpX）、0-9（△tepA）、0-9（△lonN）、0-9（△l... 

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【學位級別】：碩士

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摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)
        1.1.1 蛋白質(zhì)降解的類型
        1.1.2 蛋白酶Clp的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.3 肽酶ClpP
        1.1.4 解折疊酶的組件(ClpX/ClpA/ClpC)
        1.1.5 解折疊酶-氨基肽酶復合體
    1.2 蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)在細菌中的功能
    1.3 研究意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株
        2.1.2 實驗質(zhì)粒
        2.1.3 實驗所用引物
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 實驗試劑
    2.2 實驗過程中涉及的實驗方法
        2.2.1 快速提取蠟樣芽孢桿菌基因組DNA方法
        2.2.2 DNA快速純化回收方法
        2.2.3 GM 2163電擊感受態(tài)制備方法
        2.2.4 芽孢桿菌0-9電擊感受態(tài)制備方法
        2.2.5 質(zhì)粒小量提取方法
        2.2.6 敲除載體pMAD-XX的構(gòu)建
    2.3 實驗過程
        2.3.1 基因敲除
        2.3.2 基因缺陷型菌株和0-9野生型菌株表型測定
        2.3.3 clpX與ftsH基因回補
        2.3.4 回補型菌株表型測定
        2.3.5 clpX基因表達量的測定
        2.3.6 clpX基因鑒定
        2.3.7 clpP1,clpP2雙敲除及表型測定
3 結(jié)果與分析
    3.1 獲得ClpX/Hsp100蛋白家族基因敲除菌株
        3.1.1 ClpX/Hsp100蛋白家族基因敲除載體構(gòu)建
        3.1.2 獲得Clpx/Hsp100蛋白家族基因缺失菌株
    3.2 基因缺陷型菌株與野生型菌株表型測定
        3.2.1 細菌生長曲線測定
        3.2.2 菌體形態(tài)觀察
        3.2.3 產(chǎn)芽孢能力測定
        3.2.4 運動能力測定
        3.2.5 生物薄膜實驗
        3.2.6 合成培養(yǎng)基Msgg點板測定
        3.2.7 產(chǎn)蛋白酶測定
        3.2.8 高NaCl耐受性測定
        3.2.9 維生素K耐受性測定
        3.2.10 高溫耐受性測定
        3.2.11 菌液與真菌的平板對峙。
        3.2.12 菌體發(fā)酵液與真菌的對峙實驗
    3.3 clpX與ftsH基因回補菌株
        3.3.1 clpX與ftsH基因回補載體構(gòu)建
        3.3.2 ftsh基因回補菌株驗證
    3.4 互補菌株的表型測定
        3.4.1 芽孢觀察
        3.4.2 運動能力測定
        3.4.3 產(chǎn)生物薄膜測定
        3.4.4 菌體的觀察
        3.4.5 菌落形態(tài)的觀察
    3.5 clpX基因表達量的測定
    3.6 clpX基因的鑒定
    3.7 0-9(△clpP1 clpP2)菌株的表型測定
        3.7.1 運動性實驗
        3.7.2 生物膜實驗
        3.7.3 產(chǎn)芽孢實驗
4 結(jié)論
5 討論
6 展望
參考文獻
致謝



本文編號：3167091