真菌蛋白激發(fā)子Hrip1是從極鏈格孢菌（Alternaria alternata）中分離得到的一種超敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白,分子量為17.6KD。Hrip1誘導(dǎo)煙草細(xì)胞壞死、介質(zhì)堿化、鈣離子流動和ROS積累等一系列防御反應(yīng),并且提高煙草對TMV的系統(tǒng)抗性。為了進(jìn)一步研究Hrip1蛋白在水稻上的功能,明確Hrip1誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生防御反應(yīng)的機(jī)制。本研究在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)蛋白激發(fā)子Hrip1,并研究Hrip1誘導(dǎo)水稻抗稻瘟病的作用;通過酵母雙雜交技術(shù)篩選Hrip1在水稻中的互作蛋白,同時利用GST pull down進(jìn)一步證明了二者的相互作用;為了研究互作蛋白的功能,利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)得到了互作蛋白基因敲除的水稻突變株。獲得了以下研究成果:1、成功進(jìn)行了Hrip1的真核細(xì)胞表達(dá)成功構(gòu)建了畢赤酵母重組表達(dá)載體pPICZαA-Hrip1,轉(zhuǎn)化畢赤酵母,通過Zeocin濃度梯度篩選獲得了正確的酵母轉(zhuǎn)化子。通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析純化得到了純化的重組蛋白。Western blot檢測證明了表達(dá)該蛋白為Hrip1。重組蛋白Hr ip1具有天然Hr ip1蛋白的活性,可以引起草葉片過... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 激發(fā)子概述
        1.1.1 過敏蛋白
        1.1.2 幾丁質(zhì)
        1.1.3 鞭毛蛋白
    1.2 植物的免疫系統(tǒng)
    1.3 激發(fā)子受體的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 細(xì)菌鞭毛蛋白受體FLS2
        1.3.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)錄延伸因子受體EFR
        1.3.3 其它受體
    1.4 研究蛋白互作方法
        1.4.1 體內(nèi)蛋白互作
        1.4.2 體外蛋白互作
    1.5 Hrip1研究背景
    1.6 研究目的及意義
第二章 Hrip1的真核表達(dá)與純化
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物、菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑和儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Hrip1真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.2 畢赤酵母感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化
        2.2.3 Hrip1的真核表達(dá)
        2.2.4 Hrip1的純化
        2.2.5 蛋白濃度的測定
        2.2.6 Hrip1的Western-blotting鑒定
        2.2.7 真核表達(dá)Hrip1的活性檢測
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 Hrip1真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 重組蛋白的表達(dá)和純化
        2.3.3 重組蛋白的鑒定
        2.3.4 重組蛋白的生物活性檢測
    2.4 小結(jié)與討論
第三章 Hrip1誘導(dǎo)水稻抗病性
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 植物和菌株
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 稻瘟菌孢子制作
        3.2.2 Hrip1誘導(dǎo)水稻抗病性
        3.2.3 Hrip1處理后水稻水楊酸含量測定
        3.2.4 Hrip1處理后水稻防御酶活性測定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 Hrip1誘導(dǎo)水稻抗病性
        3.3.2 水楊酸含量的測定
        3.3.3 防御相關(guān)酶活性的測定
    3.4 小結(jié)與分析
第四章 Hrip1水稻互作蛋白的篩選
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材
        4.1.3 培養(yǎng)基與試劑配方
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 誘餌載體的構(gòu)建
        4.2.2 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞
        4.2.3 誘餌載體自激活鑒定
        4.2.4 水稻文庫篩選
        4.2.5 陽性克隆的確定
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 誘餌載體pDBleu-Hrip的構(gòu)建
        4.3.2 誘餌載體的自激活檢測
        4.3.3 水稻cDNA文庫的篩選
    4.4 小結(jié)與分析
第五章 互作蛋白的基因克隆、原核表達(dá)和體外互作驗(yàn)證
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株、質(zhì)粒和植物
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 互作蛋白的基因克隆
        5.2.2 互作蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.2.3 互作蛋白的原核表達(dá)
        5.2.4 GST pull-down實(shí)驗(yàn)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 互作蛋白基因的克隆
        5.3.2 互作蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.3.3 互作蛋白的原核表達(dá)與純化
        5.3.4 GST pull-down體外驗(yàn)證蛋白互作
    5.4 小結(jié)與分析
第六章 互作蛋白水稻突變體植株的獲得
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 植物、菌株和載體
        6.1.2 試劑和儀器
        6.1.3 培養(yǎng)基與試劑配制
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 靶位點(diǎn)的選擇
        6.2.2 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
        6.2.3 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化
        6.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的檢測
    6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.3.1 靶位點(diǎn)的設(shè)計
        6.3.2 CRISPR/Cas9重組載體的構(gòu)建
        6.3.3 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定
        6.3.4 轉(zhuǎn)基因水稻的基因編輯分析
    6.4 小結(jié)與討論
第七章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號：3166694