梨輪紋病是由葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea（B.dothidea）引起,主要危害薔薇科樹體枝干和果實(shí),尤其在蘋果和梨樹果園中普遍發(fā)生的一類枝干病害,能引起樹勢(shì)衰弱,造成爛果,致使果品質(zhì)量和產(chǎn)量受損,對(duì)果農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。真菌病毒介導(dǎo)弱毒菌株可作為生物防治真菌病害的一條主要途徑,課題組初步證實(shí)侵染梨輪紋病病菌的真菌病毒BdCV1（Botryosphaeria dothidea Chrysovirus 1）引起輪紋菌致病力衰退,具有生防應(yīng)用前景。本研究開展BdCV1抗體制備和檢測(cè)效果分析,測(cè)定BdCV1在輪紋菌中的傳染效率,分析其作為生防因子實(shí)踐應(yīng)用的可行性;證實(shí)BdCV1侵染下梨輪紋菌中mil RNA的存在和表達(dá),分析預(yù)測(cè)mil RNA介導(dǎo)靶基因的表達(dá)模式,從分子水平上探究病毒對(duì)基因的影響。取得的具體研究結(jié)果如下:1.BdCV1抗體制備及檢測(cè)效果分析采用蔗糖梯度超速離心提純LW-C菌株中BdCV1病毒粒體,免疫大耳白兔,獲得BdCV1多克隆抗體,測(cè)定抗體效價(jià)為1:51200;運(yùn)用Western blot證實(shí)了BdCV1抗體具有較好的特異性。篩選和優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù)... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：91 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

–1菌株LW-C蔗糖梯度離心后各層蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文183.1.2BdCV1病毒粒體的透射電鏡觀察將提純的BdCV1病毒液負(fù)染銅網(wǎng)后，透射電鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)僅有一種直徑大小一致的球狀顆粒，里面包裹了核酸基因組，測(cè)量其大小，直徑約為40nm（圖2–2），結(jié)果顯示獲得了純BdCV1病毒顆粒。圖2–2病毒粒子透射電子顯微鏡圖像Fig.2–2ElectronmicrographofBdCV1particlespurifiedfromLW-Cstrain.3.1.3BdCV1蛋白濃度定量分析將25%–40%（w/v）蔗糖層中的蛋白進(jìn)行提純，得到濃度較高的病毒粒體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。各取12μL病毒蛋白提純液以及等量的各濃度牛血清白蛋白進(jìn)行電泳定量分析。結(jié)果顯示，在35%、40%蔗糖梯度中，蛋白含量較高，其RdRp和未知蛋白P82蛋白濃度相當(dāng)，估算約為0.5mg/mL，未知蛋白P77蛋白濃度則較低，約為0.1mg/mL，而CP蛋白的濃度則較高，達(dá)到1mg/mL左右（圖2–3）。圖2–3SDS-PAGE分析蛋白濃度Fig.2–3SDS-PAGEanalysisBdCV1proteinstiters蛋白樣品1–4：25%、30%、35%、40%的蔗糖溶液提純所得的BdCV1Lane1–4:25%,30%,35%,40%sucrosegradientpurificationofBdCV1BSAgradients(mg/mL)蛋白樣品0.115M1234P125P79P77P82200nm

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文183.1.2BdCV1病毒粒體的透射電鏡觀察將提純的BdCV1病毒液負(fù)染銅網(wǎng)后，透射電鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)僅有一種直徑大小一致的球狀顆粒，里面包裹了核酸基因組，測(cè)量其大小，直徑約為40nm（圖2–2），結(jié)果顯示獲得了純BdCV1病毒顆粒。圖2–2病毒粒子透射電子顯微鏡圖像Fig.2–2ElectronmicrographofBdCV1particlespurifiedfromLW-Cstrain.3.1.3BdCV1蛋白濃度定量分析將25%–40%（w/v）蔗糖層中的蛋白進(jìn)行提純，得到濃度較高的病毒粒體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。各取12μL病毒蛋白提純液以及等量的各濃度牛血清白蛋白進(jìn)行電泳定量分析。結(jié)果顯示，在35%、40%蔗糖梯度中，蛋白含量較高，其RdRp和未知蛋白P82蛋白濃度相當(dāng)，估算約為0.5mg/mL，未知蛋白P77蛋白濃度則較低，約為0.1mg/mL，而CP蛋白的濃度則較高，達(dá)到1mg/mL左右（圖2–3）。圖2–3SDS-PAGE分析蛋白濃度Fig.2–3SDS-PAGEanalysisBdCV1proteinstiters蛋白樣品1–4：25%、30%、35%、40%的蔗糖溶液提純所得的BdCV1Lane1–4:25%,30%,35%,40%sucrosegradientpurificationofBdCV1BSAgradients(mg/mL)蛋白樣品0.115M1234P125P79P77P82200nm

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]梨輪紋病發(fā)生規(guī)律及防治措施[J]. 周占兵.  河北果樹. 2018(Z1)
[3]甘蔗花葉病毒衣殼蛋白的原核表達(dá)及抗血清制備[J]. 許小潔,張繼武,徐德坤,殷復(fù)偉,田延平,李向東.  山東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(08)
[4]來(lái)源于湖北省梨輪紋病菌中真菌病毒多樣性檢測(cè)及其分析[J]. 羅慧,胡旺成,王國(guó)平,王利平.  植物病理學(xué)報(bào). 2019(01)
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[6]低毒真菌病毒在植物病害生物防治中的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 劉忱,皮磊,舒燦偉,周而勛.  分子植物育種. 2018(02)
[7]來(lái)源于產(chǎn)黃青霉病毒科成員的分離物對(duì)梨輪紋病菌生長(zhǎng)及其致病力的影響[J]. 王利華,羅慧,王國(guó)平,王利平.  果樹學(xué)報(bào). 2017(10)
[8]水稻紋枯病菌不致病菌株基因組重測(cè)序以及致病力相關(guān)基因分析[J]. 周夢(mèng)琳,夏園,劉堯,何嘉瑜,張丹華,鄭愛萍.  植物病理學(xué)報(bào). 2017(06)
[9]梨輪紋病的發(fā)生規(guī)律與防治措施[J]. 朱永濤.  現(xiàn)代農(nóng)村科技. 2017(03)
[10]真菌病毒的研究進(jìn)展[J]. 唐利華,莫賤友,郭堂勛,李其利,黃穗萍.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2016(12)

博士論文
[1]湖北省水稻紋枯病菌病毒多樣性及三個(gè)與寄主毒力相關(guān)新病毒的分子特性研究[D]. 呂銳玲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]葡萄座腔菌侵染蘋果枝條過程研究及一株低致病力菌株中病毒的鑒定[D]. 丁正.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]梨輪紋病與干腐病的病原關(guān)系及輪紋病菌攜帶真菌病毒多樣性研究[D]. 翟立峰.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]柑橘衰退病毒的血清學(xué)特性分析及其誘導(dǎo)寄主差異表達(dá)基因的篩選[D]. 王彩霞.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]寨卡病毒NS1蛋白單克隆抗體的制備及其雙抗夾心ELISA方法的建立[D]. 張立定.昆明理工大學(xué) 2019
[2]一種線性雙鏈RNA病毒的鑒定及其分子生物學(xué)特性研究[D]. 莢恒霞.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]稻瘟病菌dsRNA病毒分離鑒定及其對(duì)寄主的影響[D]. 李斌.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[4]LSV 16kDa/TGB1抗血清制備及RNA沉默抑制子的鑒定[D]. 冀文婕.大連理工大學(xué) 2016
[5]熱處理對(duì)沙梨離體植株體內(nèi)microRNAs和來(lái)源于ASGV的vsiRNAs的影響[D]. 劉娟.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[6]Botryosphaeria dothidea病毒dsRNA的多樣性研究[D]. 趙迎彤.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[7]陜西省蘋果輪紋病病原菌鑒定與多樣性研究[D]. 孫鑫垚.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010
[8]蘋果莖痘病毒的鑒定及其外殼蛋白基因的原核表達(dá)[D]. 楊紹麗.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3136162