受體細(xì)胞中外源基因的表達(dá)是植物基因工程中的關(guān)鍵問(wèn)題,啟動(dòng)子是基因表達(dá)的重要調(diào)控序列之一,是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)。本研究中,通過(guò)生物信息學(xué)分析得到了一個(gè)來(lái)自橡膠樹(shù)白粉菌（Oidium heveae B.A.Steinm.）的疑似內(nèi)源啟動(dòng)子,命名為WY172。通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)、GUS染色實(shí)驗(yàn)、GUS活性分析等對(duì)該啟動(dòng)子功能進(jìn)行驗(yàn)證,引入外源功能基因HpaXm,通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)、微過(guò)敏、煙草花葉病毒（TMV）接種、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、GUS活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)對(duì)WY172驅(qū)動(dòng)HpaXm基因的表達(dá)效果進(jìn)行探究,并通過(guò)誘導(dǎo)元件分析、誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和GUS染色等對(duì)WY172的啟動(dòng)子類型進(jìn)行了分析;采取對(duì)WY172啟動(dòng)子上游2K序列進(jìn)行漸變?nèi)笔蛔�、誘導(dǎo)元件分析和啟動(dòng)子活性分析等方法進(jìn)行分析,探究WY172是否具有多元化誘導(dǎo)的可能性。主要結(jié)果如下:1.獲得了重組表達(dá)載體pBI121-GFP（轉(zhuǎn)空載體）、pBI121-ACT1（陽(yáng)性對(duì)照）、pBI121-WY172,證明WY172具有啟動(dòng)子功能,可以驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá),并且在單子葉植物水稻和雙子葉植物煙草中均能發(fā)揮啟動(dòng)子作用。2.構(gòu)建了pBI121-WY172-Hp... 

【文章來(lái)源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

不同片段插入pBI121載體的結(jié)構(gòu)示意

海南大學(xué)碩士學(xué)位論文27倍（圖2，c）。結(jié)果證明WY172是一個(gè)可以驅(qū)動(dòng)單子葉植物水稻和雙子葉植物煙草中外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子。同時(shí)為了確定不同啟動(dòng)子片段的GUS酶活性，繪制了BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線和4-MU標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2值分別為0.9997（圖3，a）和0.9994（圖3，b），滿足測(cè)定要求。SPSS軟件對(duì)酶活性的統(tǒng)計(jì)分析表明，WY172驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的活性在煙草和水稻中分別是35S和ACT1的2倍多（圖3，c；圖3，d），這證明無(wú)論是在單子葉植物水稻還是雙子葉植物煙草中，WY172均具有啟動(dòng)子活性。圖2煙草和水稻的不同菌株瞬時(shí)表達(dá)的GUS表達(dá)差異Fig.2DifferencesinGUSExpressionofTransientExpressionofDifferentAgrobacteriumStrainsinTobaccoandRice顯示了農(nóng)桿菌侵染五天后，陰性對(duì)照品系（GFP和WT）和三個(gè)轉(zhuǎn)基因品系（CaMV35S，ACT1，WY172）GUS表達(dá)的結(jié)果，其中ACT1是單子葉植物水稻中的陽(yáng)性對(duì)照，而CaMV35S是雙子葉植物煙草中的陽(yáng)性對(duì)照。a水稻和煙草瞬時(shí)表達(dá)后的GUS染色結(jié)果，b是煙草中GUS基因相對(duì)表達(dá)量，c是水稻中GUS基因的相對(duì)表達(dá)量。條形圖上方的不同小寫(xiě)字母表示不同數(shù)據(jù)的多次比較之間存在顯著差異（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，獲得一致結(jié)果。FivedaysafterAgrobacteriuminfection,thenegativecontrollines(GFPandWT)andthreetransgeniclines(CaMV35S,ACT1,WY172)GUSexpressionresults,whereACT1isapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Sisapositivecontrolofdicotyledonoustobacco.AndaistheGUSstainingaftertransientexpressionofriceandtobacco,bistherelativeexpressionlevelofGUSgeneintobacco,andcistherelativeexpressionlevelofGUSgeneinrice.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantd

橡膠樹(shù)白粉菌啟動(dòng)子WY172的克壟功能鑒定及其對(duì)HpaXm基因的調(diào)控分析28圖3煙草葉盤(pán)和水稻愈傷組織中瞬時(shí)表達(dá)的不同啟動(dòng)子的GUS活性差異Fig.3GUSDifferencesinGUSactivityofdifferentpromoterstransientlyexpressedintobaccoleavesandricecallus農(nóng)桿菌侵染五天后，測(cè)定不同菌株侵染后煙草和水稻的GUS活性，其中ACT1是單子葉植物水稻中的陽(yáng)性對(duì)照，而CaMV35S是雙子葉植物煙草中的陽(yáng)性對(duì)照。aBSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，b4-MU標(biāo)準(zhǔn)曲線，c煙草中的GUS活性，d水稻中的GUS活性。條形圖上方的不同小寫(xiě)字母表示不同數(shù)據(jù)的多次比較之間存在顯著差異（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，獲得一致結(jié)果。FivedaysaftertheinfectionwithAgrobacterium,theGUSactivityoftobaccoandriceafterdifferentstrainsofinfectionwasdeterminedACT1wasapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Swasapositivecontrolindicotyledonoustobacco.AndaisBSAproteinstandardcurve,bis4-MUstandardcurve,cisGUSactivityintobacco,disGUSactivityinrice.Theexperimentwasrepeatedthreetimestoobtainconsistentresults.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantdifferencesinmultiplecomparisonsofdata(P<0.05).Theexperimentwasrepeatedthreetimes,eachyieldingsimilarresults.3.2WY172驅(qū)動(dòng)HpaXm基因在煙草中的穩(wěn)定表達(dá)3.2.1植物表達(dá)載體pBI121-172-HpaXm的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得將pBI121-WY172及陽(yáng)性對(duì)照pBI121載體中的報(bào)告基因GUS替換為HpaXm基因，獲得了新的植物表達(dá)載體pBI121-WY172-HpaXm。并通過(guò)ATMT方法將pBI121-WY172-HpaXm及pBI121-HpaXm整合到了煙草基因組中，獲得T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株（圖4，A）。篩選了可能包含WY172和HpaXm的26

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本文編號(hào)：3133435