茶樹（Camellia sinensis）是亞洲重要的經(jīng)濟(jì)木本作物。茶小綠葉蟬是茶園首要害蟲,目前缺乏高效無害化的防治技術(shù),防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥。受害植株釋放的某些揮發(fā)物可作為一種揮發(fā)性信號(hào),引發(fā)臨近未受害植株的抗蟲反應(yīng)。因此,篩選出具有高效誘抗功能的揮發(fā)物,可為茶小綠葉蟬的防控提供新思路。本研究以茶樹12-氧-植物二烯酸還原酶基因CsOPR3作為與茶樹抗茶小綠葉蟬的分子標(biāo)記基因,并基于該基因在擬南芥上建立了一種誘導(dǎo)茶樹抗茶小綠葉蟬揮發(fā)物的快速篩選體系。利用該體系和生物測(cè)定,明確了候選物質(zhì)（E）-橙花叔醇的誘抗活性。并進(jìn)一步對(duì)其誘抗的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果主要如下:1.表達(dá)分析結(jié)果表明,機(jī)械損傷、茉莉酸（Jasmonic Acid,JA）和茶小綠葉蟬處理均能提高CsOPR3的蛋白水平;茶小綠葉蟬的取食顯著提高了CsOPR3基因的轉(zhuǎn)錄水平�？寺×瞬铇銫sOPR3基因,開放閱讀框1197 bp。構(gòu)建35S::CsOPR3過表達(dá)載體,插入opr3突變體中獲得兩個(gè)T2代純合品系。機(jī)械損傷處理后,過表達(dá)的CsOPR3基因補(bǔ)充了opr3突變體中的JA水平。同時(shí),外源JA處理顯著降低茶枝上... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

恢昃??庠竄岳蛩崠?恚?磽庖恢瓴蛔齟?懟Ｏ蠆Ａ?恐惺頭?5只成年雌性茶小綠葉蟬。茶小綠葉蟬釋放后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h記錄每個(gè)茶枝上的蟲口數(shù)量。72h后，去除裝置中茶小綠葉蟬，并記錄每株植物上的產(chǎn)卵數(shù)量。每個(gè)處理重復(fù)六次。2.2結(jié)果與分析2.2.1機(jī)械損傷、JA和茶小綠葉蟬取食處理提高CsOPR3的蛋白水平為了更好地解析茶樹CsOPR3的功能，我們檢測(cè)了機(jī)械損傷、JA處理和茶小綠葉蟬取食后茶樹中CsOPR3積累水平。結(jié)果表明CsOPR3蛋白在損傷葉中積累，并在3h達(dá)到峰值，隨后表達(dá)下降，在24h時(shí)降到很低的水平（圖2-1a）；JA處理提高了CsOPR3的積累，并在之后升高保持至24h（圖2-1a）。這一結(jié)果與前期研究報(bào)道結(jié)果CsOPR3基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果相一致（XINetal.,2017）。此外，茶小綠葉蟬的取食增強(qiáng)了CsOPR3的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平，茶小綠葉蟬取食誘導(dǎo)茶樹CsOPR3基因表達(dá)量從3h開始升高，直至24h時(shí)表達(dá)量處于最大值（圖2-1b）。圖2-1不同處理時(shí)茶葉中CsOPR3的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平。(a)機(jī)械傷害(W)、茉莉酸(JA)和茶小綠葉蟬(TLH)取食處理后茶葉中CsOPR3積累的Westernblot分析。(b)CsOPR3在茶小綠葉蟬侵染茶樹葉片和對(duì)照中的相對(duì)表達(dá)水平（t檢驗(yàn)，*P<0.05;**P<0.01）

PR3基因的功能，明確CsOPR3基因在茶樹抗蟲中的作用，構(gòu)建CsOPR3基因的過表達(dá)載體，利用設(shè)計(jì)的引物，從茶樹cDNA中克隆到CsOPR3基因的1197bp的ORF區(qū)域。利用ClaI和KpnI兩種限制性核酸內(nèi)切酶，對(duì)pCAMBIA1301與PCR產(chǎn)物雙酶切，產(chǎn)物割膠回收后用T4-DNA連接酶在4℃環(huán)境中連接，以此獲得過表達(dá)載體。2.2.3CsOPR3過表達(dá)擬南芥植株的獲得及驗(yàn)證為了驗(yàn)證CsOPR3基因是否參與茶樹中JA的生物合成，將CsOPR3基因在擬南芥opr3突變體中過量表達(dá)，獲得oeL1和oeL2兩個(gè)品系。20天大小的WT，opr3，oeL1和oeL2品系擬南生長(zhǎng)表型相一致，并無差別（圖2-2a）。Southern印跡分析表明oeL1具有單個(gè)插入，而oeL2具有雙拷貝（圖2-2b）。圖2-2擬南芥生長(zhǎng)表型和Southern印跡雜交分析。(a)20天大小的WT,opr3,oeL1和oeL2品系擬南芥的生長(zhǎng)表型。(b)Southernblot分析兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系（oeL1和oeL2）的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)Fig.2-2GrowthphenotypeandSouthernblotanalysisofArabidopsis.(c)GrowthphenotypesofWT,opr3,oeL1andoeL2linesin20-day-oldplants.(b)Southernblotanalysisoftransgenecopiesoftwoindependenttransgeniclines(oeL1andoeL2).2.2.4CsOPR3基因可能參與茶樹JA的生物合成通過機(jī)械損傷處理WT，opr3，oeL1和oeL2品系擬南芥，檢測(cè)JA含量結(jié)果如下圖所示，與野生型擬南芥相比較，opr3突變體中JA含量較低；在過量表達(dá)CsOPR3基因的opr3突變體中，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]MYC2,MYC3,and MYC4 function additively in wounding-induced jasmonic acid biosynthesis and catabolism[J]. Cuiping Zhang,Yunting Lei,Chengkai Lu,Lei Wang,Jianqiang Wu.  Journal of Integrative Plant Biology. 2020 (08)
[2]新中國(guó)成立70年來植物激素研究進(jìn)展[J]. 黎家,李傳友.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2019(10)
[3]乙烯的生物合成與信號(hào)及其對(duì)種子萌發(fā)和休眠的調(diào)控[J]. 宋松泉,劉軍,徐恒恒,張琪,黃薈,伍賢進(jìn).  作物學(xué)報(bào). 2019(07)
[4]植物-植食性昆蟲互作關(guān)系中早期信號(hào)事件研究進(jìn)展[J]. 徐麗萍,李恒,婁永根.  植物保護(hù)學(xué)報(bào). 2018(05)
[5]利用化學(xué)激發(fā)子防控作物害蟲研究進(jìn)展[J]. 胡寧寧,葉苗芬,婁永根.  植物保護(hù)學(xué)報(bào). 2018(05)
[6]茶尺蠖為害提高鄰近茶苗對(duì)茶尺蠖幼蟲的防御能力[J]. 雷舒,李喜旺,孫曉玲,王志英,辛肇軍.  茶葉科學(xué). 2016(06)
[7]植物誘導(dǎo)抗蟲性的調(diào)控機(jī)制及蛋白組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 張斌,劉洋,張玉賀,劉潔,高寶嘉.  河北林果研究. 2016(03)
[8]Language of plants: Where is the word?[J]. Maja impraga,Junji Takabayashi,Jarmo K.Holopainen.  Journal of Integrative Plant Biology. 2016(04)
[9]蟲害揮發(fā)物對(duì)鄰近棗樹直接防御反應(yīng)的激發(fā)作用[J]. 范艷玲,李新崗,韓穎,張學(xué)武.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(05)
[10]水楊酸介導(dǎo)的植物系統(tǒng)獲得抗性信號(hào)的傳導(dǎo)途徑[J]. 李占杰,師金鴿,楊鐵釗.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2006(12)

博士論文
[1]植物對(duì)斑潛蠅防御的多層次研究[D]. 張?zhí)K芳.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2010
[2]三種茶樹害蟲誘導(dǎo)茶樹揮發(fā)物的釋放規(guī)律[D]. 蔡曉明.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2009

碩士論文
[1]順-3-己烯醇誘導(dǎo)茶樹對(duì)茶尺蠖抗性的分子機(jī)制[D]. 戈林剛.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3111246