假陰性結(jié)果是影響核酸檢測結(jié)果的主要因素之一。擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)（internal amplification control,IAC）在監(jiān)控PCR過程中假陰性結(jié)果發(fā)揮著重要作用。為探索擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)在逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫?cái)U(kuò)增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA）檢測過程中的應(yīng)用,解決RT-RPA檢測過程中的假陰性問題,本研究通過復(fù)合引物法人工構(gòu)建了擴(kuò)增內(nèi)標(biāo),并應(yīng)用于大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus, SMV）、菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle virus, BPMV）及南方菜豆花葉病毒（Southern bean mosaic virus, SBMV）三種大豆病毒RT-RPA檢測過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所建立的方法能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因特異性擴(kuò)增的同時指示假陰性結(jié)果。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)50μL反應(yīng)體系中擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加量為1.83×104copies時,該體系對SMV及BPMV的檢測靈敏度為0.05 ng;擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加量為1.83×103copies時,該體系對SBMV的檢測靈... 

【文章來源】：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2020,28(12)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)構(gòu)建示意圖

圖5 BPMV的IAC-RT-RPA檢測靈敏度評價由于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的兩端分別連接有目標(biāo)檢測引物，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)與目的片段可利用同一對引物在同一RPA反應(yīng)中同時擴(kuò)增，二者之間會存在競爭，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)濃度過低則無法指示假陰性現(xiàn)象，過高則會影響檢測體系的靈敏度(丁鈿等,2019;李偉等,2019)。本研究結(jié)果表明，不同靶標(biāo)擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加量略有區(qū)別，因此，需針對不同靶標(biāo)分別進(jìn)行優(yōu)化。

結(jié)果如圖4所示。當(dāng)50μL反應(yīng)體系中擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加量為1.83×103copies時，IAC-RT-RPA方法的檢測靈敏度為10-2稀釋度，即0.5 ng，且當(dāng)模板濃度為10-1到10-7稀釋度時，出現(xiàn)了337 bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，說明不存在反應(yīng)假陰性；而當(dāng)擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加量為1.83×104copies時，IAC-RT-RPA方法的檢測靈敏度為10-3稀釋度，即0.05 ng，且當(dāng)模板濃度為10-3到10-7稀釋度時，出現(xiàn)了337 bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，說明不存在反應(yīng)假陰性。因此，本研究得出當(dāng)擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加量為1.83×104copies時，檢測靈敏度為10-3稀釋度，即0.05 ng，可用于大豆花葉病毒RT-RPA檢測過程中的假陰性結(jié)果監(jiān)測，提高結(jié)果準(zhǔn)確性。2.3.3 菜豆莢斑駁病毒評價

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在快速病原菌檢測中的價值[J]. 陳艷玲.  實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志. 2019(03)
[2]馬鈴薯斑紋片病菌IAC-PCR檢測方法[J]. 丁鈿,魏霜,李新浩,章柱,余辛,胡學(xué)難,趙文軍.  植物檢疫. 2019(05)
[3]添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA-IAC）檢測創(chuàng)傷弧菌[J]. 李偉,莊濠宇,溫爾英,張崢嶸,黃琦容,周廣彪.  檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊. 2019(03)
[4]含內(nèi)標(biāo)的多重實(shí)時PCR法同時檢測空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌[J]. 申進(jìn)玲,趙麗娜,蔣原,韓偉,袁辰剛.  食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào). 2019(07)
[5]重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在番茄黃化曲葉病毒檢測中的應(yīng)用[J]. 周瑩,楊麗梅,劉梅,黃金寶.  中國蔬菜. 2019(01)
[6]一步法逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫?cái)U(kuò)增（RT-RPA）技術(shù)檢測菜豆莢斑駁病毒[J]. 張永江,魏霜,袁俊杰,乾義柯,李桂芬,魏梅生.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(21)
[7]2017年山東口岸進(jìn)口大豆中有害生物截獲分析[J]. 李林杰,王凱,高堯華,許美玲,劉培海.  大豆科學(xué). 2018(03)
[8]一步法逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-RPA）檢測大豆花葉病毒[J]. 袁俊杰,魏霜,龍陽,馬新華,楊卓瑜,盧乃會,乾義柯,魏梅生,李桂芬,張永江.  檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊. 2018(02)
[9]南方菜豆花葉病毒RT-RPA檢測方法的建立[J]. 魏霜,袁俊杰,李桂芬,乾義柯,魏梅生,馮黎霞,胡學(xué)難,何日榮,武目濤,張永江.  植物檢疫. 2018(01)
[10]等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)展[J]. 梁海燕,劉文鑫,楊志剛.  中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新. 2017(16)

碩士論文
[1]含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR技術(shù)在犬、貓5種病毒檢測中的應(yīng)用研究[D]. 肖霞.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017



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