家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）是導(dǎo)致家蠶微粒子病的病原,寄生在活的宿主細(xì)胞內(nèi),具有真核生物的特征,是蠶種生產(chǎn)和貿(mào)易上的檢疫對象。隨著對家蠶微孢子蟲分子生物學(xué)研究的逐漸深入,對微孢子蟲生活周期的了解更加明朗,深入研究家蠶微孢子蟲侵染和復(fù)制增殖的分子機制,將為家蠶微粒子病的預(yù)知檢查和綜合防控提供理論依據(jù)。解旋酶DNA2具有解旋酶和核酸酶的作用,其參與DNA復(fù)制過程中岡崎片段的加工和成熟,并對DNA修復(fù)和端粒保護(hù)以及維持基因組完整性有重要作用。本論文在課題組建立的家蠶微孢子蟲（廣東株）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中,發(fā)現(xiàn)了家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）的解旋酶DNA2基因。通過PCR擴增和測定鑒定對家蠶微孢子蟲基因組中DNA2基因的存在進(jìn)行驗證后,根據(jù)家蠶微孢子蟲DNA2基因ORF序列設(shè)計并篩選了特異性鑒定和檢測家蠶微孢子蟲的引物。對感病家蠶中腸組織和蠶卵中的家蠶微孢子蟲DNA2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了分析測定,克隆表達(dá)家蠶微孢子蟲DNA2后,純化蛋白并對重組蛋白的ATP水解活性和解旋酶活性進(jìn)行了測定。主要獲得以下結(jié)果:（1）根據(jù)家蠶微孢子蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的DNA2基因信息,設(shè)計... 

【文章來源】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

解旋酶DNA2在真核生物岡崎片段成熟過程中的作用（仿自Kangetal.,2010）

圖1.2不同物種 DNA2的結(jié)構(gòu)及序列比對（(Kim et al., 2006）注：黑色區(qū)域為核酸酶結(jié)構(gòu)域，陰影區(qū)域為解旋酶結(jié)構(gòu)域。Hs：Homo sapien（人）；Ce：C.elegans（線蟲）；XI：X.laevis（非洲爪蟾）： Sp：S.pombe（裂殖酵母）；Sc：S.cerevisia（釀酒酵母）。位于圖示底部的刻度表示釀酒酵母 DNA2氨基酸的序列位置。在結(jié)構(gòu)上，各物種的 DNA2均具有保守的核酸酶結(jié)構(gòu)域和解旋酶結(jié)構(gòu)域，但 N 端在不同物種中長度變化較大（圖 1.2）。出芽酵母和裂殖酵母中 DNA2具有較長的 N端結(jié)構(gòu)，其它高等動物如人、非洲爪蟾等 DNA2的 N 端結(jié)構(gòu)則相對較短。Lee 等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，DNA2可被 Subtilisin 蛋白酶切割成 N 端多肽和 C 端包含解旋酶和內(nèi)切酶的多肽，缺失 N 端的 DNA2具有比全長更強的解旋酶和核酸酶活性，但是不能被 RPA激活；而且，N 端多肽能夠與具有二級結(jié)構(gòu)的 DNA 結(jié)合。DNA2的 N 端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)其與 RPA 的結(jié)合，可能通過改變 DNA2的構(gòu)象來激活它的活性。Zhou等（2015）解析了鼠 DNA2與單鏈 DNA（ssDNA）的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)（圖1.3）：DNA2的 N 端為寡核

激活；而且，N 端多肽能夠與具有二級結(jié)構(gòu)的 DNA 結(jié)合。DNA2的 N 端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)其與 RPA 的結(jié)合，可能通過改變 DNA2的構(gòu)象來激活它的活性。Zhou等（2015）解析了鼠 DNA2與單鏈 DNA（ssDNA）的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)（圖1.3）：DNA2的 N 端為寡核苷酸/寡糖結(jié)合（oligonucleotide/oligosaccharide-binding，OB）折疊結(jié)構(gòu)，接著為PD-(D/E)XK 的核酸酶結(jié)構(gòu)，C 端則為具有兩個 RecA-like 折疊結(jié)構(gòu)（1A 和2A）的解旋酶結(jié)構(gòu)域，連接核酸酶結(jié)構(gòu)和解旋酶結(jié)構(gòu)的是由兩個長的 -螺旋固定的β桶狀結(jié)構(gòu)。整體而言，DNA2形成一個圓筒結(jié)構(gòu)，核心部分為核酸酶結(jié)構(gòu)域所形成的 面圈 結(jié)構(gòu)，核酸酶的活性位點嵌入中間的通道；中間的 β 桶狀結(jié)構(gòu)和解旋酶結(jié)構(gòu)1A 位于 面圈 之上

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]柞蠶微孢子蟲檢測及感染柞蠶中腸轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 姜義仁.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012

碩士論文
[1]家蠶微孢子蟲Met-AP2基因驗證與煙曲霉素治療效果檢測[D]. 楊思佳.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016



本文編號：3091254