發(fā)布時間：2020-11-18 11:40

　　 煙草赤星病是發(fā)生于煙草成熟后期的葉部真菌病害,嚴(yán)重威脅著世界各產(chǎn)煙區(qū)的煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量。給我國國民經(jīng)濟也造成了嚴(yán)重的損失。生產(chǎn)上主要以化學(xué)藥劑防治為主,殺菌劑的長期大量使用,煙草赤星病的抗藥性問題日益突出。了解煙草赤星病的病原菌組成和病原菌的遺傳基礎(chǔ),可促進對煙草赤星病害的全面認識,為制定有效的赤星病防治措施提供信息。本研究主要對煙草赤星病菌的分離鑒定、遺傳多樣性、致病力分化以及碳氮源利用進行了系統(tǒng)地分析,主要研究結(jié)果如下:1.2014~2016年間于我國重慶等9個省市的煙草生產(chǎn)區(qū)采集典型的煙草赤星病樣品(300份),通過單孢分離共獲得289株赤星病菌。從各省市隨機挑選15株共135株進行了系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)其中有70株鏈格孢菌Alternaria alternata和65株長柄鏈格孢菌A.longipes;采用引物ITS1和ITS4對135株病原菌進行PCR擴增,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,供試菌株均與NCBI下載的小孢子種鏈格孢聚為一組,而與大孢子種鏈格孢各聚為一組,表明供試菌株為鏈格孢屬小孢子種,ITS序列可作為鑒定煙草赤星病菌的輔助技術(shù)。2.采用正交試驗設(shè)計方法對影響ISSR-PCR反應(yīng)的主要因子Mg~(2+),dNTP,Taq DNA聚合酶和引物4個因素進行了優(yōu)化試驗,并進行梯度PCR試驗確定最適退火溫度和循環(huán)次數(shù),且驗證穩(wěn)定性,建立了赤星病菌的ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系。在25μL總反應(yīng)體系中含1.00 mmol/L Mg~(2+),0.15 mmol/L dNTP,0.30μmol/L引物,0.75 U Taq DNA聚合酶,1×PCR Buffer和30.00 ng DAN模板。擴增程序為94℃預(yù)變性4 min,94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,共36個循環(huán),最后72℃延伸10 min。從40條初篩引物中,篩選出擴增條帶清晰、多態(tài)性及穩(wěn)定性較好的17條ISSR引物。3.17條引物分別對135株煙草赤星病菌的基因組DNA進行ISSR-PCR擴增,共擴增出192條譜帶,其中多態(tài)性譜帶177條,多態(tài)率為92.19%,擴增片段的大小介于100~3000 bp。UPGMA聚類分析顯示,鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌的遺傳相似性系數(shù)分別在0.67~1.00和0.66~1.00之間,遺傳相似系數(shù)為0.83可使鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌分別劃分為5個和6個亞群,其中鏈格孢菌的不同地理種群間表現(xiàn)出一定的地理相關(guān)性,長柄鏈格孢菌的不同菌株隨機分組。PopGene分析顯示,病菌種群的基因多態(tài)性和遺傳多樣性豐富,鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌的群體間遺傳分化系數(shù)(G_(ST))分別為0.36和0.37,均存在遺傳分化,兩種赤星病菌的遺傳分化結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出相似性;群居每代遷移數(shù)(Nm)分別為0.89和0.85,不同地理種群間存在基因交流。表明鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌均存在豐富的遺傳多樣性,且二者進化方向相似,ISSR標(biāo)記能較好地揭示煙草赤星病菌種群之間的親緣關(guān)系和遺傳差異性。4.采用菌絲塊創(chuàng)傷接種法,測定了135株赤星病菌對云煙87離體葉片的致病力,鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌的致病力均可分為強、較強、中等、弱和無致病力5個類型,都以致病力較強和致病力中等兩個類型的分布比例較高,致病力強、致病力弱和無致病力分布較少且均衡。兩種病原菌,其中致病力較強類型的最高分布比率出現(xiàn)在鏈格孢菌中,占38.6%,而致病力強類型的分布比例最高是長柄鏈格孢菌,占10.8%。不同省市的菌株在5個致病力類型中分布差異較大,表明我國煙草赤星病菌致病力分化差異明顯。5.采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)分析2株鏈格孢菌CQ1(中等致病力)和GZ11(中等致病力)及2株長柄鏈格孢菌HuN2(強致病力)和YN4(弱致病力)對PM1、PM2中190種碳源物質(zhì)以及PM3中95種氮源物質(zhì)的利用情況,結(jié)果顯示,4株赤星病菌對3個微孔板中碳氮源物質(zhì)利用總體一致,碳源利用率約為24.21%,氮源利用率約86.31%。不同致病力菌株的利用也表現(xiàn)出差異,長柄鏈格孢菌的強致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN6對D-甘露糖、D-木糖、D-甘露醇、b-環(huán)糊精L-纈氨酸、D-天門冬酰胺、腺苷和i-赤蘚糖醇等物質(zhì)利用更好;鏈格孢菌的中等致病力菌株CQ1比GZ11對L-鼠李糖、海帶多糖和二羥基丙酮利用更好;且弱致病力菌株YN4對水楊苷的利用比強致病力菌株HuN2和中等致病力菌株CQ1、GZ11都好。表明煙草赤星病菌種群內(nèi)個體間對碳氮源物質(zhì)的利用上存在差異,從表型上證實我國煙草赤星病菌豐富的遺傳多樣性。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.72
【部分圖文】：

第 2 章 煙草赤星病菌的分離、純化和鑒定的發(fā)病情況及發(fā)病癥狀。發(fā)現(xiàn)煙草赤星病主要發(fā)生在煙株葉部，煙株打頂后，下部葉片進入成熟階段后開始發(fā)病，逐漸向上發(fā)展。發(fā)病初期，葉片上的病斑是較小的黃褐色斑點，逐漸擴大成圓形或不規(guī)則形的深褐色病斑，邊緣明顯，直徑約1~2 cm，周圍常有黃色暈圈，具多重同心輪紋。濕度大時，病斑可以擴大為 1~2.5cm，分生孢子和分生孢子梗在上面形成深褐色或黑色茸毛狀的霉層。嚴(yán)重時，產(chǎn)生深黑色或黑色的圓形或橢圓形凹陷病斑，多個病斑能相互連接合并再枯焦脫落，造成整個葉片破碎（圖 2-2）。

圖 2-2 不同發(fā)病時期的煙草赤星病癥狀Fig. 2-2 The symptoms of tobacco brown spot at different incidence time注：A：發(fā)病初期癥狀；B：發(fā)病中期癥狀；C：濕度大時發(fā)病癥狀；D：病害嚴(yán)重時癥狀。Note: A: In the early stage; B: In the middle stage; C: In high humidity environment; D: Symptom is severe.2.2 煙草赤星病菌的致病性測定把分離到的菌株接種健康煙葉后，所有菌株均能使其發(fā)病，發(fā)病初期的癥狀為褐色斑點，后逐漸擴展成為較規(guī)則褐色斑塊，邊緣多有黃色暈圈，接種 5~7 d 后病斑逐漸變成深褐色或黑色，與田間發(fā)病癥狀很相似。致病性測定后，用離體煙葉上的病斑再次分離病原菌，獲得的二次分離菌株和接種物在形態(tài)上均一致，符合柯赫氏法則（Koch’s rule）中致病菌鑒定的要求。從而確定接種菌株是引起煙草赤星病的病原菌。2.3 煙草赤星病菌的形態(tài)鑒定2015 ~ 2017 年間從重慶等 9 個省市的煙草生產(chǎn)區(qū)采集煙草赤星病斑典型 300份，分離純化并經(jīng)致病性檢測后獲得 289 份煙草赤星病原菌（表 2-1），從各省市

貴州 Guizhou GZ 23 27.28oN, 105.29oE四川 Sichuan SC 25 26.58oN, 101.71oE湖南 Hunan HuN 28 29.45oN, 109.44oE重慶 Chongqing CQ 92 29.43oN, 106.91oE云南 Yunnan YN 19 25.04oN, 101.52oE吉林 Jilin JL 31 42.28oN, 125.74oE廣西 Guangxi GX 38 25.46oN, 107.23oE河南 Henan HeN 17 34.62oN, 112.45oE湖北 Hubei HuB 16 32.62oN, 110.79oE總計 Total 2892.3.1 鏈格孢 Alternaria alternata (Fr.: Fr.) Keissler 的鑒定A. alternata 菌株在 PCA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5 d 后，再在無菌條件下刮下菌絲置于同樣條件下培養(yǎng) 2 d，形成的分生孢子鏈呈多重分枝矮樹狀，支鏈一般由 1~5 個孢子組成，淡褐色至褐色的分生孢子單生或短鏈生，具 3~8 個橫隔膜和 1~4 個縱、斜隔膜。淡褐色的短喙呈柱狀，部分短喙可以轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)孢細胞，也稱假喙。卵形分生孢子一般 10~30 × 5~12 μm；卵圓形分生孢子一般 25~35 × 4~9 μm（圖 2-3）。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2888675