家蠶蛹作為一種優(yōu)質蛋白源,因其營養(yǎng)豐富、蛋白含量高、味道鮮美,一直是人們喜愛的食物之一。但是由于家蠶蛹中存在一些致敏原導致在實際生活中有少數(shù)人會發(fā)生食入家蠶蛹過敏的情況,這不但制約了家蠶蛹在食品上的應用,還危害著人們的健康。因此深入研究家蠶蛹內的致敏原種類和致敏機理,對開發(fā)培育安全的家蠶蛹品種具有重要的意義。本文旨在分析不同品種家蠶蛹致敏原蛋白表達水平的差異,從種質資源的源頭篩選開發(fā)出致敏性較低且適合食用的家蠶蛹品種,主要研究結果如下:1、家蠶蛹致敏原基因轉錄水平的差異研究。選擇102份不同品種的蠶蛹作為供試材料,利用實時熒光定量技術(qRT-PCR),通過檢測不同品種家蠶蛹中7種主要致敏原基因(家蠶假定表皮蛋白30、胰凝乳蛋白酶抑制劑、小熱休克蛋白20.8、卵黃原蛋白、幾丁質酶、30K家族蛋白、丙糖磷酸異構酶)的轉錄水平,初步篩選出致敏原基因轉錄水平較低的家蠶蠶蛹品種。結果發(fā)現(xiàn):1007、4034、4020、2016、2030的蠶蛹體內致敏原基因的轉錄水平相對較低。2、家蠶小熱休克蛋白20.8(HSP 20.8)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI-8A)的原核表達及抗體的制備。通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增HSP 20.8和CI-8A基因,連接pET-28a構建原核表達載體,轉入至大腸桿菌BL21細胞進行誘導表達。結果顯示:擴增得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列一致,成功構建HSP 20.8和CI-8A的原核表達載體,獲得大小分別為28 KDa和47 KDa左右的重組蛋白,符合預測結果,同時成功制備抗體,效價分別為1:51200和1:25600。3、家蠶蛹致敏原蛋白水平的表達差異研究。提取各品種的家蠶蛹總蛋白,利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對家蠶蛹總蛋白進行分離,經濕法轉膜后利用免疫印跡方法(Western-blot)將上述制備的抗體與分離后家蠶蛹總蛋白進行反應,從而檢測蠶蛹中致敏原蛋白的含量。結果顯示:2025品種的家蠶蛹中致敏原HSP 20.8和CI-8A的含量最低,認為該品種可以作為相對安全可食用性候選蠶蛹品種進行培育。
【學位單位】：江蘇科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S881.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 致敏原研究進展
        1.1.1 致敏原概述
        1.1.2 食物過敏的機制
        1.1.3 食物過敏動物模型研究
        1.1.4 致敏原的檢測技術
    1.2 致敏原致敏的機理
        1.2.1 致敏原的抗原表位
        1.2.2 致敏原的分子模擬
    1.3 家蠶致敏原的研究進展
        1.3.1 家蠶致敏原的致敏方式
        1.3.2 家蠶致敏的臨床表現(xiàn)
        1.3.3 家蠶致敏原的致敏成分
        1.3.4 家蠶蛹致敏原分子生物學研究
    1.4 本研究的目的與意義
    1.5 本研究的主要內容
第2章 家蠶蛹致敏原基因轉錄水平表達差異
    2.1 實驗材料與設備
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 實驗儀器設備和試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 家蠶蛹RNA的提取
        2.2.2 反轉錄反應
        2.2.3 實時熒光定量分析
    2.3 結果與分析
    2.4 討論
第3章 原核表達及多克隆抗體制備
    3.1 實驗材料與設備
        3.1.1 試劑和實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 RNA提取與反轉錄反應
        3.2.2 PCR擴增反應
        3.2.3 目的片段膠回收
        3.2.4 目的基因與載體的酶切、純化、連接
        3.2.5 轉化及克隆測序
        3.2.6 重組DNA的篩選和鑒定
        3.2.7 誘導表達
        3.2.8 His柱洗脫
        3.2.9 抗體制備
    3.3 結果與分析
        3.3.1 HSP20.8和CI-8A基因的克隆
        3.3.2 原核表達及抗體制備
    3.4 討論
第4章 家蠶蛹致敏原在蛋白水平表達的差異
    4.1 實驗材料
        4.1.1 設備與試劑
        4.1.2 常用試劑和緩沖液的配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 家蠶蛹總蛋白的提取
        4.2.2 蠶蛹總蛋白濃度定量
        4.2.3 SDS-PAGE分析
        4.2.4 Western-blot檢測
    4.3 結果與分析
    4.4 討論
結論與展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間所發(fā)表的論文
致謝

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本文編號：2883799