煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)作為專性的胞內(nèi)寄生物,與寄主細(xì)胞環(huán)境關(guān)系非常密切并完全依賴寄主細(xì)胞環(huán)境,這種依賴性需要病毒蛋白和核酸能夠轉(zhuǎn)換寄主因子的正常功能~([1])。這使得病毒病的防治極為艱難。長(zhǎng)期以來(lái),研究人員在生物源制劑、化學(xué)制劑以及利用基因工程等方面來(lái)防治煙草花葉病毒有了許多研究,但是依然沒(méi)有取得大的進(jìn)展。因此深入研究TMV侵染寄主免疫的分子基礎(chǔ),有利于研究對(duì)TMV的防治。本研究采用iTRAQ技術(shù)檢測(cè)了病毒侵染煙草不同時(shí)間段蛋白質(zhì)組的變化,分析了響應(yīng)TMV侵染的代謝途徑變化并且篩選出關(guān)鍵蛋白;以此為檢測(cè)靶標(biāo),結(jié)合抗性基因的表達(dá)和產(chǎn)生的病斑數(shù)目,檢測(cè)我們復(fù)配的TMV防治劑的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、對(duì)煙草品種K326接種TMV后,采用iTRAQ技術(shù)檢測(cè)了不同時(shí)間段蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的變化,結(jié)果顯示12h vs CK中有144個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中90個(gè)上調(diào)表達(dá),54個(gè)下調(diào)表達(dá);24hvsCK有163個(gè)差異蛋白,其中90個(gè)上調(diào)表達(dá),73個(gè)下調(diào)表達(dá);36hvsCK有178個(gè)差異蛋白,其中97個(gè)上調(diào)表達(dá),81個(gè)下調(diào)表達(dá)。對(duì)三組差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能注釋:結(jié)果顯示這些差異蛋白質(zhì)主要反映在“電子載體活性”,“催化活性”,“轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控”功能領(lǐng)域;生物途徑的差異變化主要反映在“代謝過(guò)程”,“細(xì)胞過(guò)程”,“生物調(diào)節(jié)過(guò)程”。2、以整個(gè)蛋白質(zhì)組為背景,P≦0.05為限制條件,對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果顯示:接種TMV 12h誘導(dǎo)的差異蛋白分別聚集在“Biosynthesis of secondary metabolites”,“Terpenoid backbone biosynthesis和“Photosynthesis”等途徑;接種TMV 24h誘導(dǎo)的差異蛋白主要聚集“在Starch and sucrose metabolism”,“Terpenoid backbone biosynthesis”和“Photosynthesis”等途徑;接種TMV 36h誘導(dǎo)的差異蛋白主要聚集在“Protein export”,“Photosynthesis”和“Porphyrin and chlorophyll metabolism”等途徑;表明TMV在侵染煙株的36h內(nèi),其對(duì)光合系統(tǒng)的影響是非常顯著的。對(duì)這三個(gè)時(shí)間段TMV誘導(dǎo)的特異蛋白質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)分析,結(jié)果顯示這三個(gè)時(shí)間段表達(dá)的差異蛋白大部分都分別富集在“RNA degradation”,“Porphyrin and chlorophyll metabolism”以及“Photosynthesis”,進(jìn)一步表明TMV侵染對(duì)光合系統(tǒng)的影響。3、接種TMV后,光合途徑中上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)目逐漸增加,下調(diào)蛋白的數(shù)目逐漸減少;而卟啉代謝與葉綠素代謝途徑中上調(diào)蛋白數(shù)目減少,下調(diào)蛋白逐漸增多。說(shuō)明TMV在侵染煙株的過(guò)程中,煙株體內(nèi)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)代償性表達(dá)。通過(guò)提高卟啉代謝與葉綠素代謝中一些蛋白的表達(dá)水平,代償性彌補(bǔ)光合系統(tǒng)的減弱,以最大限度維持植物生存的需要。4、通過(guò)不同方式給煙株噴施制劑A和制劑B,結(jié)果顯示:在煙株感染TMV前,施用制劑B,能夠提高煙株卟啉代謝與葉綠素代謝途徑中關(guān)鍵基因和抗病基因的表達(dá)水平以及防御酶活性,增強(qiáng)煙株對(duì)TMV的抵抗能力;同時(shí),降低TMV對(duì)光合系統(tǒng)的破壞;半葉法檢測(cè)TMV侵染后煙葉的發(fā)病表型,也呈現(xiàn)出制劑B對(duì)防治煙草花葉病具有顯著效果。
【學(xué)位單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.72
【部分圖文】：

圖 1 Bradford 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)樣品的含量測(cè)定。 酶切和除鹽取 100μg 蛋白質(zhì)，體積整體調(diào)節(jié)到 100μL，然后加入 500μL50mM NH4HCO3稀釋，加ryspin 酶液；7℃消化過(guò)夜 8~16h；樣品編號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 標(biāo)準(zhǔn)品公式 y = 0.4389x - 0.0085 R2 = 0.9907樣品吸光度 0.218 0.167 0.194 0.196 0.192 0.165 0.153 0定濃度（μg/μL） 0.087 0.065 0.077 0.077 0.076 0.064 0.059 0稀釋倍數(shù) 50 50 50 50 50 50 50 樣品實(shí)際濃度（μg/μL）4.4 3.2 3.9 3.9 3.8 3.2 2.9

SDS-PAGE膠圖

兩條帶的強(qiáng)度明顯高于對(duì)照，且 36h的樣品在 45 與 66.2 kDa 左右處蛋白聚集較多。SDS-PAGE 電泳結(jié)果如下：圖 2 SDS-PAGE 膠圖4.1.2 蛋白質(zhì)定性分析4.1.2.1 鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)本次實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)譜產(chǎn)生的二級(jí)譜圖數(shù)、解析的二級(jí)譜圖數(shù)分別為 387554、143349，譜圖鑒定率達(dá)到了 36%以上，鑒定到的肽段和蛋白數(shù)總體情況請(qǐng)參見(jiàn)表 3.2表 4 蛋白質(zhì)鑒定信息統(tǒng)計(jì)總表.樣品名總譜圖數(shù) 鑒定譜圖數(shù)* 譜圖鑒定率 鑒定肽段數(shù)* 鑒定蛋白數(shù) Unique-2**ALL 387554 143349 36.99% 27942 4880 3556注：*表示可信度至少為 95%，**表示至少含有 2 個(gè) unique 肽段的鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目4.1.2.2 重復(fù)性分析重復(fù)性分析指的是通過(guò)分析生物重復(fù)樣品數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性，以判斷實(shí)驗(yàn)操作的重復(fù)性和儀器的穩(wěn)定性，重復(fù)性分析主要從同一樣品不同生物重復(fù)的 CV 值分析角度出發(fā)。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2878128