小麥孢囊線蟲(CCN)對(duì)全球小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。對(duì)小麥與CCN親和互作的研究可以提高我們對(duì)CCN調(diào)控宿主發(fā)育,免疫及代謝途徑的理解,并進(jìn)一步有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)新的控制策略。在本研究中,我們對(duì)小麥感病品種溫麥19(Triticum aestivum L.cv.Wen19)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。對(duì)接種CCN后第1,3和8天(dpi)的Wen19根組織樣品進(jìn)行了RNA-Seq測(cè)序分析。共鑒定了71569個(gè)基因,其中10929個(gè)基因?yàn)轫憫?yīng)CCN侵染的差異表達(dá)基因(DEGs)。基于功能注釋和GO分析發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)磷酸化,氧化還原過(guò)程,代謝過(guò)程,轉(zhuǎn)運(yùn),轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),抗性響應(yīng)以及許多其他先前報(bào)道的途徑在轉(zhuǎn)錄水平上富集。植物細(xì)胞壁水解和修飾蛋白,生長(zhǎng)素生物合成,信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在線蟲侵染后上調(diào),可能與小麥孢囊線蟲侵入,在根內(nèi)遷移及合胞體的建立相關(guān)。響應(yīng)傷害和茉莉酸刺激相關(guān)基因在1dpi上調(diào)表達(dá)基因中富集,但在3dpi和8dpi中沒(méi)有富集。我們發(fā)現(xiàn)16個(gè)NBS-LRR差異表達(dá)基因,其中12個(gè)在3dpi下調(diào),表明進(jìn)一步的抗性反應(yīng)被抑制。在CCN侵染期間,抗氧化酶,谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)水平顯著上調(diào),可能是小麥Wen19與CCN親和互作的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。總之,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組方法獲得的結(jié)果表明,氧化還原過(guò)程,抗性誘導(dǎo)和抑制,代謝,轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因可能參與Wen19與CCN的互作,為小麥與CCN互作潛在的機(jī)制研究提供了新的見(jiàn)解。同時(shí)線蟲效應(yīng)因子的研究對(duì)線蟲防控具有重要意義。本研究同時(shí)以小麥孢囊線蟲效應(yīng)因子Ha-63744為研究對(duì)象,明確了其由線蟲食道腺細(xì)胞分泌,在宿主中定位于細(xì)胞核,在CCN 6個(gè)齡期均表達(dá),但在發(fā)育后期表達(dá)量高。利用體外RNAi及VIGS沉默靶基因,能夠顯著降低其侵染率和雌蟲數(shù)量,擬通過(guò)超表達(dá)研究其對(duì)宿主根發(fā)育及線蟲致病性的影響,從而驗(yàn)證Ha-63744基因功能,揭示該效應(yīng)因子在線蟲侵染、發(fā)育、致病及與宿主互作過(guò)程中的功能,為控制其爆發(fā)和促進(jìn)我國(guó)小麥的穩(wěn)定健康生產(chǎn)提供新思路。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士后
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.121.49
【部分圖文】：

ｕｎｃｔｉｏｎａｌ?ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ｇｅｎｅｓ?（ＤＥＧｓ）?ｏｆ?Ｗｅｎ?１９?ｉｎ?ｒｅｓ．??Ｎｏ．?ｏｆ?Ｎｏ．?ｏｆ?ＤＥＧｓ?Ｎｏ．?ｏｆ?ＤＥＧｓ?ｉｎ?Ｎｏ．?ｏｆ?ＤＥＧｓ?ｉｎ?Ｎｏ．?ｏｆ??ＤＥＧｓ?ｉｎ?ＮＲ?Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ?ＫＥＧＧ?ｉｎ?Ｃ３６４９?２９８２?２３７７?Ｈ３６?１５０６０２９?５２２８?４１０３?３７４７?２５５１２５１?１０３７?７９０?６９７?４７１０９２９?９２４７?（８１．７２％）?７２７０?（７９．５５％）?５５８０?（５１．０６％）?５４３（４９．７５圖結(jié)果表明，在７９２５個(gè)上調(diào)基因中，共有２４０個(gè)基因在３個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)連續(xù)上調(diào)，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)，包括１２４１個(gè)基因在１和３?ｄｐｉ時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)，２６５個(gè)時(shí)間點(diǎn)都上調(diào)表達(dá)，以及５３８?jìng)�(gè)基因在３到８?ｄｐｉ時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)。僅在１，?達(dá)的基因數(shù)量分別為１２４７，?２９２８和３８２個(gè)（圖ｌａ）。只有３個(gè)基因在〗ｄｐｉ，間點(diǎn)都顯著下調(diào)（圖ｌａ）。共有２４２個(gè)基因在任何兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)下調(diào)表達(dá)，包１和３?ｄｐｉ時(shí)間點(diǎn)下調(diào)表達(dá)，６個(gè)基因在１和８?ｄｐｉ時(shí)間點(diǎn)下調(diào)表達(dá)，以及４０ｄｐｉ時(shí)間點(diǎn)下調(diào)表達(dá)。僅在ｌｄｐｉ，３ｄｐｉ和８ｄｐｉ的獨(dú)特下調(diào)的基因數(shù)量分別為９３１（圖ｌｂ）。??

在ＣＣＮ侵入根部ｌｄｐｉ時(shí)，發(fā)現(xiàn)２１７８?jìng)�(gè)ＤＥＧｓ（ＦＤＲ＜０．００１），其中１２４７個(gè)上調(diào)，９３１??個(gè)下調(diào)。上調(diào)表達(dá)基因富集分析表明，１０１個(gè)基因參與蛋白質(zhì)磷酸化，７５個(gè)基因涉及代謝過(guò)??程，４０個(gè)基因參與轉(zhuǎn)運(yùn)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且３２個(gè)基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖２ａ）。植物細(xì)胞壁修飾??可以促進(jìn)線蟲的入侵和移動(dòng)。我們發(fā)現(xiàn)１２個(gè)與植物型細(xì)胞壁相關(guān)基因由ＣＣＮ誘導(dǎo)表達(dá)（圖??２ａ）。氧化還原過(guò)程中的基因，對(duì)傷害的反應(yīng)和對(duì)茉莉酸刺激的反應(yīng)基因在上調(diào)基因中極大地??富集，這表明在線蟲侵入的早期誘導(dǎo)了宿主抗性（圖２ａ）。而轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，ＲＮＡ甲基化，??氧化應(yīng)激反應(yīng)，蛋白水解，囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)，脂質(zhì)代謝過(guò)程基因在下調(diào)表達(dá)基因中富集（圖??２ｄ）。??在ＣＣＮ侵入根部３?ｄｐｉ時(shí)，發(fā)現(xiàn)４２５１個(gè)ＤＥＧｓ?（ＦＤＲ?＜０．００１），其中２９２８上調(diào)，１３２３??下調(diào)。ＧＯ富集分析顯示，參與蛋白質(zhì)磷酸化，氧化還原過(guò)程，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，代謝過(guò)程，跨膜轉(zhuǎn)??運(yùn)的基因在３ｄｐｉ上調(diào)和下調(diào)基因中都富集（圖２ｂ，ｄ），但囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在下??調(diào)表達(dá)基因中富集（圖２ｄ）。??在８?ｄｐｉ時(shí)，ＧＯ富集顯示參與蛋白質(zhì)磷酸化，應(yīng)激反應(yīng)，氧化還原過(guò)程，防御反應(yīng)和代??謝過(guò)程

第三章小麥孢囊線蟲效應(yīng)因子基因Ｈａ－６３７４４功能初步分析???３．１．８擬南芥超表達(dá)基因，分析其對(duì)植物根發(fā)育及線蟲侵染的影響??采用Ｇａｔｅｗａｙ法將幻７�；虻模茫模有蛄兄亟M到帶有ｅＧＦＰ和潮霉素抗性標(biāo)記的雙元??載體ＰＨ７ＷＧ２Ｄ中（Ｏｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，２００９）。凍融法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１中，通過(guò)花浸法轉(zhuǎn)化??擬南芥，篩選純合子（Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ?ｅｔａｌ．，?２０１２；?Ｃｌｏｕｇｈ?ａｎｄ?Ｂｅｎｔ，?１９９８）。觀察超表達(dá)基??因?qū)χ参锔蛋l(fā)育的影響，同時(shí)接種小麥孢囊線蟲３００頭，觀察對(duì)線蟲侵染及致病的影響。??３．２結(jié)果??３．２．１小麥孢囊線蟲候選效應(yīng)因子基因幻７＃克隆與序列分析??在前期轉(zhuǎn)錄組研究數(shù)據(jù)中獲得基因序列，通過(guò)ＰＣＲ技術(shù)獲得ＯＲＦ全長(zhǎng)（圖４）。??采用ＳｉｇａｌＰ３．０和ＴＨＡＭＭ軟件預(yù)測(cè)其具有信號(hào)肽但不含有跨膜結(jié)構(gòu)域的序列（圖５）。??
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